Estudos enzimológicos para compreender a função da NPP1 na regulação da biomineralização - Andrilli, Luiz Henrique da Silva (2022)
Ossificação endocondral é mediada pelas vesículas da matriz (MV), uma classe especial de vesículas extracelulares responsáveis por iniciar a precipitação de fosfato de cálcio. Essas vesículas são enriquecidas por duas enzimas principais: (a) fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP), possuindo atividade fosfomonohidrolítica, produzindo fosfato inorgânico (Pi) pela hidrólise de adenosina-5\'-trifosfato (ATP) e de pirofosfato (PPi); e (b) ectonucleotideo pirofosfatase/fosfodiesterase 1 (NPP1), uma ATP fosfodiesterase, produzindo adenosina-5\'-monofosfato (AMP) e PPi. Nesse estudo investigamos a cinética do ATP usando lipossomos incorporados com NPP1 e TNAP como modelos biomiméticos das MV e os efeitos da combinação de ambas enzimas na mineralização in vitro. A NPP1 foi solubilizada com sucesso, resultando em alta porcentagem de recuperação proteica e atividade enzimática. Em seguida, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), esfingomielina (SM) e colesterol (Chol) foram utilizados na composição lipídica dos lipossomos. Nesses lipossomos, foi incorporada a NPP1 e posteriormente caracterizados por Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), Potencial Zeta e Microscopia de Força Atômica (AFM). Estudos anteriores com TNAP-proteolipossomos constituídos apenas por DPPC mostraram um grande potencial de propagação mineral. O mesmo foi observado nos NPP1-proteolipossomos. Assim, esta composição foi utilizada para incorporação de NPP1 e TNAP simultaneamente em proporções proteicas de 1:1, 1:10 e 10:1, estudando o comportamento cinético de ambas enzimas ao longo do processo de biomineralização utilizando ATP, resultando em dados inéditos. As cinéticas dos proteolipossomos foram obtidas por quantificação empregando-se Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) de adenosina-5\'-difosfato (ADP) e AMP como produtos da hidrolise de ATP. As proporções de 10:1 e 1:10 de NPP1 para TNAP resultaram na queda da atividade catalítica. De outra forma, na proporção 1:1 a atividade enzimática geral aumentou. A presença do inibidor específico da NPP1 (suramina) resultou em um declínio significativo na atividade enzimática para todas as proporções. Além disso, esse efeito foi mais acentuado em NPP1-proteolipossomos, destacando a seletividade da suramina. Todos os ensaios de mineralização in vitro usando proteolipossomos mostraram propagação mineral. NPP1-proteolipossomos mostraram dois estágios na curva de mineralização, o segundo estágio é semelhante a toda curva obtida para TNAP-proteolipossomos, devido a mudança na atividade da NPP1, de fosfodiesterase para fosfomonohidrolase. Os minerais formados no ensaio de mineralização foram secos e analisados por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier - Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR). Os espectros revelaram um aumento na correlação fosfato/carbonila (PO4^3-/C=O). Da mesma forma, analisando as bandas de FTIR-ATR para TNAP- e NPP1:TNAP-proteolipossomos (diferentes proporções), observou-se a presença de hidroxiapatita (HAp) derivada do octacálcio fosfato (OCP), enquanto para NPP1-proteolipossomos uma pequena porção de pirofosfato de cálcio dihidratado (CPPD), bem como HAp derivada de OCP foi observada. Assim, lipossomos contendo ambas as enzimas foram uma maneira efitiva de estudar passo a passo a mineralização mediada pela atividade enzimática, reforçando a tese de que os sistemas miméticos são uma notável metodologia para entender as vias que levam a formação/inibição de minerais nas MV.