Caracterização funcional das proteínas gigantes tipo calpaína-like presentes na região do FAZ de Trypanosoma cruzi usando o sistema CRISPR/Cas9 - Silva, Lays Adrianne Mendonça Trajano (2021)
O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, é um protozoário unicelular que possui características biológicas e genômicas únicas. Atualmente, dois medicamentos possuem eficácia comprovada apenas na fase aguda da doença, e por não existir vacinas, a busca por métodos que possibilitem novas terapêuticas são necessárias. Neste contexto, o estudo da biologia do parasito contribui para elucidar mecanismos pelo qual o T. cruzi consegue sobreviver aos mais variados ambientes, e desta forma identificar alvos que podem ser utilizados como vias terapêuticas. Na família Trypanosomatidae foi descrita a presença de proteínas de alta massa molecular localizadas na Zona de Adesão Flagelar (FAZ) com papel importante na manutenção da forma, organização e proliferação celular. Neste contexto, proteínas gigantes (PGs) foram identificadas na região do FAZ em tripanossomatídeos, sendo caracterizadas principalmente em T. brucei. No entanto, em T. cruzi as PGs permanecem não caracterizadas. Através de espectrometria de massas (MS), identificamos seis proteínas de alta massa molecular presentes na fração do citoesqueleto de T. cruzi. Com 18 hits, a proteína gigante tipo Calpaina-like cisteína peptidase (denominada de ClpGP), de 13.716pb, presente no cromossomo 39, haplótipo Non-Esmeraldo-like do T. cruzi CL Brener, foi escolhida para seguir com os estudos funcionais. Portanto, este projeto teve como objetivo de caracterizar o papel funcional da ClpGP presente no citoesqueleto de T. cruzi. Para analisar a distribuição da ClpGP no T. cruzi CL Brener epimastigota, produzimos anticorpos específicos utilizando a proteína recombinante e um peptídeo sintético, ambos construídos na região N-terminal da proteína. As análises por microscopia confocal demonstraram a localização desta proteína na região do FAZ, na porção do corpo celular, denominado de domínio FAZ intracelular. Com a recente utilização do sistema de edição gênica por CRISPR/Cas9 em tripanossomatídeos, tornou-se possível o estudo funcional de proteínas em T. cruzi. O RNA guia (sgRNA) desenhado para a ClpGP também reconheceu quatro genes de Clp presentes no cromossomo 39, mas no haplótipo Esmeraldo-like. A estratégia utilizada neste estudo foi capaz de promover a edição dos cinco genes presentes nos dois haplótipos de T. cruzi CL Brener de uma única vez. O nocaute dos genes da Clp no T. cruzi, forma epimastigota, promoveu um encurtamento do corpo celular, produzindo formas semelhantes a promastigota. Além disso, foi observado mudanças na organização celular, acúmulo de microtúbulos subpeliculares e defeitos no bolso flagelar. As modificações após o nocaute não afetaram a proliferação celular dos parasitas mutantes, quando comparados ao controle. Usando o anticorpo anti-TcFAZ, que reconhece um grupo de PGs (acima de 1000kDa) presentes no FAZ, observamos que o mutante não apresenta marcação na região do FAZ em ensaios de microscopia confocal e nem por western blotting. A edição de cinco genes alvos, pertencentes a mesma família de proteínas, é inédito em tripanossomatídeos. Nossos resultados sugerem que as Clps podem ter um papel na manutenção e organização celular da forma epimastigota em T. cruzi. Também nossos dados indicam que as Clps podem estar envolvidas na mudança de forma do parasita durante o ciclo de vida, podendo ter um papel chave na adaptação e sobrevivência do parasita em seus hospedeiros. Estes achados podem fornecer respostas sobre o modo de vida do T. cruzi e poderá futuramente auxiliar no desenvolvimento de novas drogas alvos para combater à doença.