Sequenciamento de nova geração do gene IRF4: identificação de variações associadas a fenótipos de pigmentação na população brasileira - Oliveira, Maria Luiza Guimarães de (2016)
O gene fator regulador de interferon 4 (IRF4), localizado na região cromossômica 6p25- p23, é um membro da família de fatores reguladores de interferon (IRF), um grupo de fatores de transcrição de ligação ao DNA, sendo IRF4 primariamente associado ao desenvolvimento e resposta imune e expresso exclusivamente em células do sistema imunológico e em linhagens melanocíticas. Embora muitos estudos tenham associado IRF4 a diversas condições, como melanoma e leucemia linfocítica crônica, um recente Genome-Wide Association Study (GWAS) identificou que alelos do SNP rs12203592 (intron 4) estão associados com variação fenotípica em relação à presença de sardas, pigmentação da pele, cabelos e olhos. Estudos funcionais realizados em células melanocíticas humanas e de camundongos revelaram que este SNP está diretamente envolvido na regulação da expressão de IRF4, sugerindo uma clara função na pigmentação do melanócito. Apesar destes achados, a diversidade das regiões regulatórias e codificadora de IRF4 não foi até o momento analisada em populações miscigenadas. A fim de avaliar se outros sítios de variação ao longo do gene IRF4 podem estar associados à pigmentação humana, as regiões regulatórias (promotora e 3´UTR) e codificadora (9 exons e regiões intrônicas flanqueadoras, incluindo o SNP rs12203592) foram analisadas por sequenciamento de nova geração em uma amostra miscigenada da população brasileira. A amostra populacional foi composta por 228 indivíduos não aparentados de Ribeirão Preto, estado de São Paulo, Brasil, os quais foram estratificados de acordo com a pigmentação da pele (clara, média e escura), olhos (azul, verde, castanho-claros e castanho-escuros), cabelo (ruivo, loiro-claro, loiroescuro, castanho-claro, castanho-escuro e preto) bem como em relação à presença de sardas e intensidade de cabelos grisalhos. Bibliotecas de DNA foram preparadas utilizando o Sistema de Enriquecimento de Alvo Haloplex (Agilent Technologies) e sequenciadas na plataforma MiSeq (Illumina). Os pacotes de software CutAdapt, BWA and GATK foram utilizados, respectivamente, para trimagem das sequências dos adaptadores, alinhamento e identificação de variantes. Haplótipos e alelos não identificados foram inferidos pelo método PHASE, embora a fase conhecida entre os sítios de variação (obtida pelo GATK) tenha sido levada em consideração. Um total de 105 sítios de variação foram identificados. Apenas dois deles apresentaram frequências genotípicas que não atendem ao esperado pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Dezoito destes SNPs apresentaram forte associação a pelo menos uma característica de pigmentação. Entretanto, se a conservadora correção de Bonferroni para múltiplos testes for levada em consideração, apenas duas associações, ambas envolvendo o SNP rs12203592, permanecem significativas: a associação do alelo T com pele clara e olhos azuis. Este resultado está de acordo com estudos prévios, que reportam que o alelo rs12203592*T leva a uma menor ativação de IRF4 e a uma expressão reduzida da tirosinase, resultando em sensibilidade ao sol e olhos azuis. Foi inferido um total de 101 haplótipos, estando a distribuição destes de acordo com o esperado pelo EHW. Quando os haplótipos foram divididos em haplótipos da promotora, codificadora e 3´UTR foram observadas, respectivamente, 17, 29 e 37 diferentes combinações haplotípicas. Várias associações foram identificadas, particularmente envolvendo o haplótipo mais frequente da promotora, os dois haplótipos mais frequentes da codificadora e o haplótipo mais frequente da 3´UTR, todos associados com pele clara, olhos azuis, cabelos castanhos e cabelos grisalhos. Estes resultados sugerem que outras variantes além de rs12203592, quando consideradas em um contexto haplotípico, são associadas com a pigmentação humana.