Uso de inibidores das histonas deacetilases na transferência nuclear de células somáticas em bovinos - Sangalli, Juliano Rodrigues (2016)
A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (TNCS) ainda é afetada pela baixa eficiência. As modificações epigenéticas estabelecidas durante o processo de diferenciação celular estão entre os principais fatores. Uma vez que estas modificações atuam como barreiras epigenéticas restringindo a reprogramação do núcleo somático. Considerando isso, a maioria dos fatores que promovem a descondensação da cromatina, incluindo os inibidores das Histonas Deacetilases (HDACis), tem sido demonstrado aumentarem a eficiência da reprogramação nuclear, tornando o seu uso comum para melhorar as taxas da TNCS. Neste trabalho, nós testamos dois inibidores das histonas deacetilases: o Ácido Valpróico (VPA) e o Ácido β-Hidróxibutírico (BOHB), sendo um farmacológico e o outro um metabólito endógeno na TNCS. Nosso objetivo era testar se o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos com estes HDACis melhoravam o desenvolvimento de embriões bovinos clonados. Em relação ao VPA, nós observamos que o tratamento de fibroblastos com o VPA aumentou a acetilação das histonas e a expressão de genes importantes para o desenvolvimento como IGF2R e PPARGC1A. Entretanto, quando as células tratadas foram usadas como doadoras de núcleo, não foi observado diferença nos níveis de acetilação das H3K9 entre os grupos. Além disso, as alterações foram rapidamente removidas após a transferência nuclear. Em relação as taxas de desenvolvimento, o uso de células tratadas como doadoras de núcleo não resultou em diferença durante o desenvolvimento pré- e pós-implantacional. Em relação ao BOHB, nós executamos um série de experimentos para testar se esta molécula age como um inibidor das HDACs em bovinos. Nós observamos que fibroblastos tratados com BOHB apresentam aumento nos níveis globais de H3K9ac. O tratamento altera a expressão de genes importantes como os transportadores de glicose e a enzima chave no metabolismo lipídico SCD. Também, nós demonstramos que este metabólito é capaz de alterar uma marca epigenética em zigotos clonados, que persiste até o estágio de blastocisto. Entretanto, o tratamento dos zigotos com este metabólito endógeno não aumentou a taxa de desenvolvimento pré-implantacional, embora tenha alterado a expressão de um fator de transcrição que protege embriões contra estresse oxidativo, o FOXO3a. O tratamento de zigotos partenogenéticos com BOHB não afetou o desenvolvimento embrionário, nem a produção de ATP, sugerindo que o BOHB não apresenta efeitos tóxicos como anteriormente pensado. Concluindo, os resultados deste trabalho mostram que a inibição das HDACs através de uma molécula farmacológica ou um metabólito endógeno, não aumenta a eficiência da TNCS em bovinos. Entretanto, aqui nós mostramos que o corpo cetônico BOHB pode ser um elo de ligação entre o ambiente extracelular e a regulação do metabolismo. E serve como um modelo in vitro para testar como distúrbios metabólicos como a cetose afeta o metabolismo e epigenoma celular e embrionário em bovinos