Desenvolvimento de uma cell factory a partir do fungo termofílico Thermothielavioides terrestris - Lima, Awana da Silva (2024)
O desenvolvimento e o fortalecimento de uma bioeconomia dependem da geração de novas tecnologias capazes de utilizar fontes renováveis, como resíduos provenientes da biomassa vegetal, para a obtenção de produtos e compostos de valor agregado. Neste cenário, o desenvolvimento de microrganismos como cell factories para a produção de enzimas lignocelulolíticas tem ganhado destaque devido à necessidade de obter linhagens mais eficientes, visando diminuir os custos dos processos de sacarificação destes materiais. Dentre os microrganismos, o fungo termofílico Thermothielavioides terrestris apresenta potencial para se tornar uma cell factory para a produção de coquetel enzimático, pois possui em seu genoma, uma vasta gama de genes que codificam enzimas ativas em carboidratos, conferindo uma alta capacidade degradadora de compostos lignocelulósicos. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo explorar e desenvolver ferramentas para manipular geneticamente o fungo termofílico T. terrestris visando a construção de uma cell factory. Inicialmente, foi realizado o cultivo do fungo em diferentes meios alternativos para obter melhores taxas de esporulação. Dentre os meios avaliados, o cultivo em extrato de tomate e trigo para quibe apresentou as melhores taxas de esporulação, alcançando valores superiores a 1 x 109 esporos/ml. A estratégia escolhida para a manipulação genética do fungo envolveu a substituição do locus do gene cre1 pelo gene de resistência a higromicina B, hph. Para isso, foi feita a determinação da concentração inibitória mínima (MIC) de T. terrestris em higromicina B, que foi de 500 μg/ml. O protocolo de manipulação genética em T. terrestris baseou-se na transformação dos protoplastos mediada por PEG, via split marker. Os fragmentos doadores do split marker foram obtidos por PCR usando como template o cassete de deleção pEX- Δ cre1, que foi desenvolvido neste trabalho. Das 6 colônias fúngicas obtidas na placa de seleção, uma delas apresentou uma banda com peso molecular correspondente ao gene hph. Esta cepa foi selecionada para análise. Diversas tentativas foram feitas para confirmar a deleção por meio de PCR de diagnóstico, no entanto essas análises não foram conclusivas. Com isso os fragmentos foram sequenciados e foi identificado a sequência do gene hph no genoma da cepa mutante. Análises de cultivo em bagaço de cana-de-açúcar (SCB) foram realizadas para observar se houve mudanças no fenótipo do microrganismo mutante. A cepa mutante apresentou um aumento de 8 vezes na quantidade de proteínas totais após 96 h de cultivo. Análises de atividade enzimática de celulases em Avicel indicaram um aumento de 65% comparado com a cepa selvagem. Houve um decréscimo na atividade de celulases em 72 e 96 h, apesar de ainda ser superior à cepa selvagem. Essa queda na atividade pode ser decorrente da ação de proteases no meio. A atividade de protease dos secretomas demonstrou um aumento de 1.62, 3.35 e 26.5 vezes nos cultivos de 48, 72 e 96 h, respectivamente, comparado com o selvagem. Diante dos resultados obtidos, foi possível observar que houve uma mudança significativa no fenótipo da cepa obtida por engenharia genética, indicando que houve alguma alteração no locus do gene cre1.