Estudo cinético da produção da proteína recombinante Amblyomin-X pela bactéria Escherichia coli BL21DE3-Rec1 - Mello, Caroline Matos de (2018)
O câncer é um problema de saúde pública, especialmente entre os países em desenvolvimento. Está entre as doenças de maior taxa de mortalidade e é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo. Uma proteína denominda Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma Cajennense e expressa na bactéria Escherichia coli BL21DE3. Essa proteína é capaz de induzir a morte de células tumorais, além de ter pouca ou nenhuma atividade contra células normais, diminuindo assim os efeitos colaterais nos pacientes em tratamentos contra o câncer. Através deste trabalho foi possível elaborar um protocolo para obtenção de elevadas concentrações celulares e produção da proteína recombinante AmblyominX em biorreatores com capacidade total de 15 L. Uma vez que a proteína é intracelular, foram estudados alguns parâmetros e estratégias de cultivo do microrganismo para obtenção de alta concentração celular, tais como: composição do meio de cultura, identificação dos substratos limitantes e inibitórios e vazão de alimentação da fonte de carbono. Foi definido um meio de cultura adequado para atingir elevadas concentrações celulares na etapa de crescimento da E. coli, visando garantir elevadas concentrações de produto recombinante. Ensaios conduzidos em biorreatores com esse meio resultaram em concentrações celulares e densidade ótica (DO600nm) iguais a 40,0 g/L e 76,6, respectivamente, para a etapa de crescimento celular e 59,8 g/L e 161, respectivamente, no final da etapa de produção da proteína de interesse. Os ensaios conduzidos em reatores mostraram que concentrações de ácido acético acima de 0,4 g/L causam inibição do crescimento celular, portanto, foi elaborada uma estratégia eficaz de alimentação exponencial dos substratos limitantes (fontes de carbono e magnésio) na etapa de crescimento dessa bactéria para atingir elevadas concentrações celulares, mantendo-se a velocidade específica de crescimento (µx) menor que 0,2 h-1, abaixo do valor máximo, com a finalidade de evitar a formação de ácido acético. Este trabalho permitiu também conhecer os parâmetros cinéticos para a produção da proteína Amblyomin-X, tais como, a velocidade específica máxima de crescimento (max), a produtividade celular global (Pxglobal), a produtividade celular máxima (Pxmáx) e o fator de conversão de substrato em célula (Yx/s) na etapa de batelada alimentada, cujos valores foram, respectivamente, de 0,30 h-1, 13,8 g de célula/h, 14,1 g de célula/h e 0,37 g de célula/g de substrato. Para a avaliação da biossíntese da proteína recombinante foram realizadas análises de gel de poliacrilamida por eletroforese e a quantificação foi feita pela análise de Bradford. A concentração de proteína Amblyomin-X no final da etapa de síntese alcançou 8,57 g/L.