Caracterização fenotípica e genotípica de bactérias multirresistentes quanto à sensibilidade a clorexidina em células planctônicas e em biofilme - Rosin, Ana Paula Marchi (2023)
Introdução: Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são uma das principais causas de mortalidade e morbidade e um importante problema com altos custos para os sistemas de saúde. Antissépticos como a clorexidina (CHG) podem ser uma alternativa na redução dos casos de colonização da pele. Entretanto, mecanismos de resistência, como bombas de efluxo, já foram descritos por estarem relacionados com a resistência dos microrganismos a CHG. Além disso, a presença de biofilme permite que as bactérias sobrevivam em diferentes ambientes. Objetivos: Avaliar a tolerância a clorexidina em microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos multirresistentes em células planctônicas e em biofilme; validar a técnica de disco difusão para determinação in vitro de sensibilidade a clorexidina; caracterizar genética e filogeneticamente microrganismos Gram-negativos com concentração inibitória mínima elevada para clorexidina. Materiais e Métodos: Concentração Inibitória Mínima pelo método de diluição em ágar (DA) e microdiluição em caldo (DC) com e sem o inibidor de bomba de efluxo CCCP em 132 isolados; Padronização de método de disco difusão (DD) com clorexidina utilizando 10 isolados com diferentes perfis de sensibilidade a CHG; Análise do Desempenho do Disco de CHG nas concentrações de 5 g e 100g; Produção de biofilme e Concentrações mínima de eliminação de biofilme (CMEBs) com CHG em 38 isolados; Curadoria dos principais mecanismos de resistência a CHG; Análise de concordância entre os métodos utilizando teste de kappa e correlação entre os métodos utilizando o teste de Spearman. Resultados: A resistência a clorexidina pelo método de DA e DC foi de 67,0% (59/88) e 19,3% (17/88) para Enterobactérias (K. pneumoniae e S. marcescens), 18,2% (8/44) e 6,81% (3/44) para não fermentadores (P. aeruginosa e A. baumannii), respectivamete. A resposta ao CCCP nos métodos DA e DC foi de 97,5% (39/40) e 100% (2/2) para K. pneumoniae, 100% (17/17) e 100% (15/15) para S. marcescens e 100% (5/5) e 100% (3/3) em A. baumannii, respectivamente, tiveram diminuição 4 diluições da CIM. Não houve formação de zona de inibição no disco com 5g de clorexidina e no disco de 100g os tamanhos dos halos variaram de 4 - 17mm. No cenário de resistência CIM 32 g/mL, os isolados de K. pneumoniae foram os únicos que apresentaram concordância boa (k = 0,48) entre os métodos DA e DD, para o halo de 16 mm, atendendo os critérios do CLSI. No cenário de resistência CIM 64 g/mL, para S. marcescens obtivemos concordância boa com halos de 12mm (k = 0,58), 13mm (k = 0,65) e 14mm (k = 0,60) nos métodos de DA e DD e 12 mm (k = 0,42) e 13 mm (k = 0,49) nos métodos de DC e DD, mas não atendiam os critérios do CLSI. A produção de biofilme foi testada em 38 isolados Gram-negativos e 06 Gram-positivos. Biofilme forte foi observado em 84,2% dos isolados Gram-negativos e 50,0% em Gram-positivos; moderado em 13,2% e 50,0%, respectivamente. Um isolado Gram-negativo foi não produtor de biofilme. Valores de CMEBs variaram de 128 a 16.384 g/mL em Gram-negativos e de 32 a 16.384 g/mL em Gram-positivos. O fenômeno Eagle effect foi observado em 60,5% (n=23) dos isolados em condição de biofilme, elevando a CIM para 16.384 g/mL e para até 8.192 g/mL em células planctônicas. Em K. pneumoniae, o gene cepA foi observado em 100% dos isolados, seguido dos genes smvAR (90,6%), qacE (85,9%) e qacE (15,6%). Em S. marcescens os genes sdeXY e qacE foram encontrados em 100% das amostras e o gene qacE em 12,5%. Em A. baumannii os genes adeAB foram observados em 100% dos isolados e o gene adeC em 58,6%, os genes aceIR em 93,1% e o gene qacE em 3,44% e nenhum isolado tinha o gene qacE e em P. aeruginosa os genes mexCD-oprJ, qacE e cepA estavam presentes em 100% das amostras, já os genes nfxB e qacE em 93,3% dos isolados. Conclusão: Neste estudo demonstramos um grande percentual de isolados com CIM elevadas para clorexidina, em especial nos isolados de K. pneumoniae e S. marcercens. O CCCP foi capaz de reduzir a CIM para CHG nos isolados de K. pneumoniae, S. marcescens e A. baumannii, exceto para P. aeruginosa. O teste de disco difusão não foi capaz de discriminar isolados sensíveis e resistentes, bem como estabelecer um ponto de corte como fator seletivo de resistência a CHG. O Eagle effect foi um importante achado no nosso estudo levantando um alerta à ocorrência deste fenômeno para evitar falsos resultados de sensibilidade. Não houve diferença entre a presença dos genes de resistência e o perfil de sensibilidade a clorexidina em nenhum dos microrganismos