Sistematização de um método de análises quantitativas para a diferenciação hematopoética de células-tronco embrionárias humanas in vitro - Coqueiro, Igor Lopes (2019)
As células-tronco e progenitores hematopoéticos (CTPH) são capazes de reconstituir todo o sistema sanguíneo de um indivíduo adulto e por isso apresentam um grande potencial terapêutico. Por muito tempo as células-tronco embrionárias humanas (CTEh) têm sido estudadas como fonte de CTPH in vitro. No entanto a transferência dessa tecnologia para a clínica ainda é um grande desafio. Parte disso se deve às limitações técnicas dos protocolos de diferenciação in vitro que impedem a sistematização de estudos funcionais em larga escala de genes e fatores implicados na regulação deste processo. Nesse sentido a realização de análises quantitativas de diferente condições experimentais poderiam contribuir na compreensão dos mecanismos envolvidos no comprometimento de CTEh com a linhagem hematopoética. Para isso o presente trabalho propõe estabelecer um método de análise da diferenciação hematopoética de CTEh por um conjunto de abordagens de microscopia quantitativa conhecida como High-content screening (HCS). Utilizamos as linhagens de CTEh H1 e H9-GFP para induzir a diferenciação hematopoética em um sistema de cultivo em monocamada em microplacas de 96 poços utilizando um meio indutor quimicamente definido. Utilizamos marcadores envolvidos no processo de transição epitélio mesênquima (TEM) e marcadores hematopoéticos para a realização de ensaios de imunofluorescência que foram analisados por HCS. Em nosso ensaios vimos que a inibição seletiva da enzima GSK3? por 24 h já causa alterações morfológicas significativas nas colônias de CTEh. As análises por HCS revelaram que até o 4º dia de diferenciação a família de fatores de transcrição Snail coordena a TEM das CTEh regulando negativamente os níveis de E-caderina ao passo que os níveis de Ncaderina são aumentados. Nesse momento fomos capazes de formar um endotélio hemogênico in vitro de células CD34+ no qual emergem células progenitoras hematopoéticas CD34+CD43+ que progressivamente perdem sua assinatura endotelial à medida que se comprometem com a linhagem hematopoética até adquirir o marcador CD45 no 12º dia de diferenciação. Nossos dados sugerem que o presente método de análise consiste em um modelo operativo de grande valia para a realização de screenings funcionais em larga escala para o estudo dos estágios iniciais da hematopoese humana.