Controle epigenético da via de Wnt/β-catenina no acúmulo de células-tronco tumorais quimiorresistentes em carcinoma oral - Milan, Thaís Moré (2022)
O carcinoma oral é responsável por muitas mortes ao redor do mundo por originar recidivas e metástases devido as falhas na terapia. Os tratamentos convencionais destroem as células diferenciadas do tumor, porém a população de células-tronco tumorais é resistente e repovoa o tumor. A sinalização de Wnt/β-catenina está envolvida na manutenção, sobrevivência, auto-renovação e diferenciação das células-tronco tumorais e sua sinalização pode ser regulada por modificações epigenéticas. O objetivo do projeto foi identificar alterações epigenéticas envolvidas no controle da via de sinalização de Wnt/β-catenina e de seus alvos e investigar a participação da via no acúmulo de células-tronco tumorais e na quimiorresistência de linhagens celulares de carcinoma oral. Três linhagens de carcinoma oral selvagens (Cal27 WT; SCC9 WT; SCC25 WT) e resistentes à cisplatina (Cal27 CisR; SCC9 CisR; SCC25 CisR) e suas populações de células-tronco tumorais (CTT+) e não-tronco tumorais (CTT-) foram investigadas. Análises de qPCR foram realizadas para a avaliação da expressão gênica e Western Blot para avaliação dos níveis proteicos; a dose IC50 dos inibidores foi determinada por ensaio de viabilidade celular. Citometria de fluxo e formação de esferas identificaram as CTT+. Imunoprecipitação da cromatina foi realizada para identificar a regulação epigenética da via. O ensaio de xenoenxerto foi utilizado para investigar o potencial da via de Wnt/β-catenina como alvo terapêutico. Nós observamos o aumento da expressão de genes reguladores da maquinaria epigenética, como BRD7, EZH2, KDM4C e MLL1 e do gene CTNNB1, que codifica β-catenina, nas linhagens resistentes à cisplatina. Os genes upstream da via de Wnt/β-catenina, como APC e GSK3β, estavam diminuídos nas 3 linhagens quimiorresistentes, e os genes downstream FGF18 e MMP7 estavam aumentados. A população de CTT+ apresentou maior expressão de genes envolvidos na metilação de histonas. β-catenina e as histonas metiladas H3K27me3 e H3K9me2 também estavam aumentadas nas linhagens resistentes à cisplatina e nas CTT+. O inibidor de EZH2 (UNC1999) e os inibidores de β-catenina (ICG-001 e FH535) reduziram a população de CTT+ e diminuíram as proteínas β-catenina e EZH2 nas linhagens quimiorresistentes. H3K27me3 também foi diminuída após tratamento com os inibidores. O tratamento com UNC1999 aumentou a expressão dos genes upstream APC e GSK3β, e os tratamentos com ICG-001, FH535 e UNC1999 foram efetivos na diminuição do gene downstream MMP7 nas CTT+. FH535 demonstrou eficácia para diminuir a população de CTT+, especialmente quando combinado com cisplatina e UNC1999. Os inibidores de β-catenina em monoterapia ou combinados com cisplatina e UNC1999 diminuíram o fenótipo tronco (stemness) das CTT+. Houve redução do crescimento tumoral após a administração de FH535, FH535+cisplatina e UNC1999+FH535, e diminuição dos marcadores β-catenina, EZH2, H3K27me3 e dos marcadores de células-tronco tumorais OCT4 e SOX2 no tecido tumoral. Através da imunoprecipitação da cromatina nas linhagens quimiorresistentes e nas populações de CTT- e CTT+, nós identificamos que EZH2 interage fortemente com a região promotora dos genes APC, FGF18 e VEGFA, e de forma menos intensa com os promotores de AXIN2, GSK3β e MMP7, aumentando a presença de H3K27me3, o que promove a repressão dos genes APC, GSK3β e VEGFA que participam da via de Wnt/β-catenina. Dessa forma, os resultados demonstram que β-catenina e EZH2 estão aumentados nas linhagens quimiorresistentes e na população de células-tronco tumorais, e a metilação de histonas participa de forma crítica, controlando a via de Wnt/β-catenina, através da inibição dos genes reguladores upstream APC e GSK3β, levando à translocação de β-catenina para o núcleo, onde se liga à fatores de transcrição e regula seus genes downstream como MMP7, participando da regulação das células-tronco tumorais. A administração de inibidores farmacológicos da via de Wnt/β-catenina e de EZH2 pode ser uma estratégia eficaz para o tratamento do carcinoma oral e eliminação das células-tronco tumorais.