Modulação da viabilidade de fibroblastos cardíacos em cultura frente a hipóxia: papel de diferentes concentrações de glicose - Malfitano, Christiane (2010)
Estudos mostram que a exposição ao meio hiperglicêmico ou diabetes protege o coração contra insultos patológicos, incluindo isquemia. A ativação de fatores anti-apoptóticos e proliferativos parece estar envolvida com esta cardioproteção. Este estudo foi desenhado para investigar a modulação da viabilidade de fibroblastos cardíacos submetidos à hipóxia tratados previamente com meio hiperglicêmico, e os efeitos de 15 dias de infarto do miocárdio (IM) na função ventricular em ratos diabéticos sobre os fatores de morte e sobrevida celular. Foram utilizados ratos Wistar machos e as análises foram realizadas no ventrículo esquerdo. Para as análises in vitro, os fibroblastos cardíacos foram obtidos por digestão enzimática (tripsina/colagenase), e cultivados em dois meios: baixa Glicose (5mM) e alta Glicose (25mM análogo ao plasma diabético). As células confluentes (80%) foram submetidas à hipóxia por incubadora modular com gás (5,6% de CO2 e 94,4% de N2); após as células foram mantidas em estufa a 37ºC por 6; 12; 24; 48 e 72hs. Experimentos de citometria de fluxo foram realizados para análise da viabilidade celular e fragmentação de DNA, ambas para verificação de apoptose e confirmadas pelas medidas de AnexinaV/FITC/IP. A expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi medida no sobrenadante dos meios por ELISA. Para as análises in vivo, os ratos foram divididos (N=8/grupo) em grupos: controle (C), diabético (D), infartado (I) e diabético infartado (DI). Quinze dias após a indução do diabetes ou não, com injeção de estroptozotocina (50mg/Kg) ou tampão citrato, os grupos I e DI foram submetidos à ligadura da artéria coronária. Após 15 dias de IM e/ou 30 de diabetes, a função cardíaca (sistólica e diastólica) foi analisada por ecocardiograma, além da avaliação do tamanho do IM em 24 horas e 15 dias. As citocinas inflamatórias foram medidas por ELISA, a expressão gênica dos fatores de morte e sobrevida celular foram avaliados por PCR em tempo real, a atividade da caspase 3 foi medida por espectrofluorimetria, e a expressão protéica dos transportadores de glicose (GLUT) por Western blotting. A densidade capilar e a fibrose do coração foram quantificadas por análise histológica. A viabilidade celular mostrou homogenia em todos os tempos de hipóxia e em ambos os tratamentos de glicose. Em 6 horas verificamos fragmentação do DNA com marcação dos fosfolípides de membrana (apoptose) e % elevada de morte em ambos os tratamentos até 12hs. Após 24hs, ocorreu adaptação, havendo aumento de VEGF e diminuição da fragmentação do DNA com 48hs; após 72hs, observou-se apenas que o VEGF continuava aumentado. No meio hiperglicêmico, os valores de VEGF estavam maiores e a fragmentação menor quando comparados ao meio hipoglicêmico. O grupo DI apresentou melhora na função sistólica (fração de ejeção e de encurtamento), acompanhada de manutenção da função diastólica (tempo de relaxamento isovolumétrico e tempo de desaceleração do pico E), redução de 36% do tamanho do IM, redução das citocinas pró-inflamatórias (TNF- e IL-1), com ativação da apoptose (expressão aumentada de Fas, p53, Bax e atividade de caspase 3) e aumento dos fatores de sobrevivência celular (Bcl-2, HIF-1, VEGFa e IL8r). Além disso, o grupo DI apresentou aumento do GLUT-1 com diminuição do escore de fibrose e aumento da densidade capilar; resultados comparados ao grupo I. Este cenário é, provavelmente, um mecanismo de compensação, associado ao saldo positivo entre genes regulatórios relacionados com a sobrevivência celular programada, redução de citocinas inflamatórias, aumento da utilização de glicose como substrato energético, redução da fibrose e angiogênese. Em conjunto, estes achados sugerem uma maior plasticidade e resistência celular de fibroblastos cardíacos frente à hipóxia sendo esta favorecida pela hiperglicemia crônica em ratos diabéticos