Estudo sobre a expressão dos genes de alfa amilase de Bacillus stearothermophilus e de anopheles merus em células de bactéria, levedura e inseto - Effio, Pedro Jorge Chimoy (2001)
O gene A1 da alfa amilase foi isolado de uma biblioteca genômica em lambda EMBL3, feita com DNA do díptero primitivo Anopheles merus (Díptera, Nematocera, Culicoidea). Ele foi parcialmente seqüenciado, caracterizado pelo padrão da clivagem das enzimas restritivas e clonado no plasmídeo pIBI24 por Pernasetti (1991 ). No presente trabalho relata-se sua expressão em: bactéria (Escherichia coli AD494), células de inseto ( Spodoptera frugiperda) e em levedura (Pichia pastoris), tendo-se observado que somente nas células de Spodoptera frugiperda a enzima é expressa com atividade. A expressão extracelular do gene A1 foi ensaiada em E.coli AD494 usando o vetor pRSETc. Para este fim a seqüência do gene contendo seu próprio peptídeo sinal, foi inserida em fase de leitura (\"frame\") nesse vetor. A expressão sem peptídeo sinal foi executada usando o vetor pAE2, uma construção derivada- do pRSETc. Numa outra construção, o gene A1 foi inserido em fase de leitura após a seqüência do promotor e do peptídeo sinal do gene A2 (alfa amilase de Bacillus stearothermophilus) utilizando-se o vetor pIBI24-Bst. As células de E.coli AD494 transformadas com estes construções expressaram a enzima sem atividade. A amilase A1 não foi secretada nem com seu peptídeo sinal nem com o da amilase A2. A expressão do gene A1 em levedura (Pichia pastoris) foi feita usando o vetor pPic9, que permite a expressão tanto intracelular quanto a secreção da proteína. O gene foi amplificado por PCR usando \"primers forward\" com o intuito de obter o gene com ou sem peptídeo sinal. O gene contendo o peptídeo sinal foi construído com diferentes seqüências tipo Kozak precedendo o códon ATG. Para a expressão extracelular usou-se o peptídeo sinal do fator alfa do pPic9. Os resultados mostraram que a enzima é expressa mas que permanece dentro da célula sem atividade. As mesmas construções do gene A1 feitas para Pichia foram inseridas em Baculovírus para transfectar células de Spodoptera frugiperda. Neste sistema a amilase foi expressa com atividade principalmente no sobrenadante das culturas transformadas com construções usando o gene contendo o seu próprio peptídeo sinal assim com o peptídeo sinal da amilase de Zabrotes subfasciatus. O gene da alfa amilase de Bacillus stearothermophilus foi expresso no sistema Baculovírus-Spodoptera e na levedura Pichia, usando o gene contendo o peptídeo sinal da amilase de Z. subfasciatu. A proteína foi secretada e tinha atividade em ambos os sistemas.