Atividade inulinolítica extracelular em Kluyueromyces marxianus - Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães (1990)
O presente trabalho teve como principal objetivo caracterizar a atividade inulinolítica de K. marxianus. Para isso foram conduzidos experimentos em linhagens com propriedades contrastantes, tendo sido identificada e caracterizada a enzima envolvida, e determinadas as fontes de modulação do sistema. A análise eletroforética do sobrenadante das culturas permitiu a identificação da banda relativa a inulinase, sendo constatado a existência de apenas uma enzima no sistema. Essa enzima possui peso molecular aparente de 94 Kd, e a estrutura de sua banda indica a existência de glicosilação. Em cultura, a enzima apresentou-se estável por pelo menos 48 h, com a maior parte da produção pelas células ocorrendo na fase estacionária. A temperatura ótima de atividade situa-se entre 30 e 40°C, havendo forte inativação após os 50°C, e inativação total a partir dos 60°C. Quanto ao pH, a enzima apresenta atividade hidrolítica entre 2,5 e 8,0, porém o seu pico situa-se em 6,5, sendo observado variações bem acentuadas nas proximidades desse ponto. Células inteiras apresentam a capacidade de hidrolisar inulina, e por autólise com clorofórmio e tolueno foi possível isolar a enzima da parede, tendo essa apresentado o mesmo padrão eletroforético da extracelular. Devido a fragilidade da parede de K. marxianus, chegou-se a conclusão de que a atividade extracelular é consequência de pequena capacidade do envoltório de reter as proteínas no espaço periplasmálico, não havendo um sistema específico para a exportação ao meio de cultura. Variações na atividade inulinolítica foram observadas quando diferentes fontes de nitrogênio foram avaliadas. Nos diferentes ensaios foi demonstrado que na ausência de extrato de levedura, peptona ou uréia não ocorre atividade extracelular. Em linhagens apresentando repressão catabólica, foi verificado que só ocorre atividade extracelular na presença de inulina. Carboidratos relacionados, como a sacarose, não substituem o polímero para esse efeito. Comparando-se os sistemas Killer e inulinase, verificou-se que em condições de aumento da exportação da toxina Killer, há uma consequente redução da atividade inulinolítica específica. A explicação para tal fato pode estar na competição das duas enzimas pelo sistema celular de secreção. A nível genético, foi constatado que, à semelhança do que é verificado para linhagens de K. lactis em relação ao sistema da lactose, para a inulinase de K. marxianus muitas linhagens de ocorrência natural não apresentam repressão por glicose. Da análise dos híbridos entre linhagens desreprimidas, parcialmente desreprimidas e reprimidas, chegou-se à conclusão da existência de ao menos dois elementos transnegativos atuando no sistema. A linhagem IZ 619, apresentando grande atividade inulinolítica extracelular, foi avaliada para a exportação de proteína. Em meio complexo, após 4 dias em cultura a linhagem apresentou, em comparação com uma linhagem industrial de S. cerevisiae, um excedente na produção de 270 mg/l. Considerando-se que cerca de 90% da proteína exportada foi identificada como inulinase, conclui-se pela propriedade do uso de um sistema como esse na produção de peptídeos heterológos.