Genes cuticulares diferencialmente expressos durante eventos da metamorfose de Apis mellifera - Soares, Michelle Prioli Miranda (2012)
A cutícula dos insetos é composta principalmente por uma variedade de proteínas que interagem com filamentos de quitina, um polímero de N-acetilglicosamina, para formar um envoltório rígido que protege e dá forma ao organismo. O crescimento dos insetos depende da renovação periódica da cutícula, que se desprende durante a apólise e é digerida enquanto a epiderme sintetiza uma nova cutícula substituta. Tal renovação caracteriza a muda e metamorfose e é coordenada por hormônios, com destaque para os ecdisteróides. O atual trabalho objetivou caracterizar a expressão diferencial de genes do tegumento (cutícula e epiderme subjacente), além de elucidar aspectos de regulação e função no contexto da muda e metamorfose, com foco nos genes codificadores de proteínas estruturais e enzimas cuticulares. Para este fim, utilizamos o tegumento de fases específicas da muda pupal-adulta, isto é, de pupas (Pw), de pupas em apólise (Pp) e de adultas faratas (Pbl) para análises de microarrays de cDNA. As análises dos microarrays mostraram 761 e 1173 genes diferencialmente expressos nos tegumentos de adultas faratas (Pbl) em comparação com pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp), respectivamente. A categorização destes genes, segundo os critérios do Gene Ontology, distinguiu totalmente o tegumento de adultas faratas (Pbl) dos tegumentos de pupas (Pw) ou pupas em apólise (Pp) tanto em relação ao critério Processo Biológico quanto em relação à Função molecular, evidenciando grande mudança na expressão gênica durante a construção do exoesqueleto definitivo nas adultas faratas (Pbl). Os microarrays mostraram aumento estatisticamente significante da expressão de 24 genes cuticulares no tegumento de adultas faratas. Este resultado foi validado por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) para 23 destes genes (AmelCPR3, AmelCPR4, AmelCPR6, AmelCPR14, AmelCPR15, AmelCPR17, AmelCPR23, AmelCPR24, AmelCPR25, AmelCPR28, AmelCPR29, AmelCPR30, apd-1, apd-2, apd-3, CPLCP1, Am-C, Am-D, AmelTwdl1, AmelTwdl2, GB12449, GB12811 e GB11550), e por RT-PCR semiquantitativa para o gene Amlac2. Além disto, a maior expressão de outros 2 genes cuticulares (AmelCPR1 e AmelCPR2) em adultas faratas foi demonstrada por qRT-PCR. Estes genes cuticulares positivamente regulados no tegumento de adultas faratas (Pbl) devem estar envolvidos com a formação e diferenciação do exoesqueleto definitivo. O aumento da expressão gênica neste período da muda (Pbl) é regulado pela variação do título de ecdisteróides e ocorre enquanto o título deste hormônio decai, após ter atingido o pico indutor da apólise na fase de desenvolvimento precedente (Pp). Ao contrário, as análises por qRT-PCR mostraram que 2 outros genes cuticulares (AmelCPF1 e AmelCPR1) são negativamente regulados no tegumento de adultas faratas em comparação com pupas, sugerindo que são específicos de cutícula pupal. Estes genes foram inibidos pelo aumento dos níveis de ecdisteróides, que induz a apólise. Vinte e um entre os 24 genes cuticulares diferencialmente expressos nos microarrays codificam proteínas pertencentes às famílias CPF, CPR, Apidermina, CPLCP, Análoga a peritrofina e Tweedle. Os outros 3 genes diferencialmente expressos (GB12449, GB12811, GB11550) não tinham sido ainda caracterizados como genes cuticulares. Dois deles, GB12449 e GB12811, foram sequenciados para validação da predição e para a caracterização das respectivas estruturas genômicas. Experimentos de hibridação in situ com sonda fluorescente (FISH) nos permitiram localizar altos níveis de transcritos destes genes no citoplasma de células da epiderme de adultas faratas, sugerindo fortemente sua natureza cuticular e envolvimento na construção do exoesqueleto definitivo. O presente estudo consiste na primeira análise global de expressão de genes do tegumento de uma espécie de himenóptero social. Os resultados apresentados levaram à identificação de genes com expressão associada à muda pupal-adulta e formação do exoesqueleto definitivo. Este trabalho contribui com novos dados moleculares para o aprofundamento do conhecimento da metamorfose de A. mellifera.