Perfil metabólico no meio de cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com o sexo cromossômico - Teixeira, Namíbia Aparecida (2023)
O objetivo do presente estudo foi avaliar os diferentes perfis metabólicos do meio de cultivo de embriões bovinos machos e fêmeas, com finalidade de determinação do sexo embrionário de forma não invasiva e com elevada acurácia. Para isto, foram utilizados oócitos oriundos de ovários de abatedouro de genética predominantemente Bos indicus, os quais foram fertilizados com quatro touros distintos Bos indicus. Do total de embriões produzidos foram selecionados blastocistos de grau 1 de qualidade e foram distribuídos nos seguintes grupos: Machos (embriões machos, n = 79) e Fêmeas (embriões fêmeas, n = 80), além de um grupo em Branco (meio de cultivo sem estrutura, n = 49), para este total foram realizadas 4 repetições biológicas. No dia 4 de seu desenvolvimento, os embriões foram colocados em gotas de cultivo individual onde permaneceram até o dia 7. Neste momento, o sexo do embrião foi determinado pela amplificação do gene TPSY por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR), e a análise metabólica untarget foi realizada utilizando-se o meio de cultivo das gotas individuais pela técnica ionização por eletrospray (ESI). O software online MetaboAnalyst 5.0 foi utilizado para análises estatísticas. Para avaliar as diferenças entre embriões machos e fêmeas na expressão de metabólitos, foi realizada uma análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA). Em uma análise preliminar sem separar pelo estágio de desenvolvimento dos embriões foi possível verificar uma sobreposição de metabolitos. Assim, foi realizado, a análise separada para cada um dos três diferentes estágios de desenvolvimento: blastocistos (BL), blastocistos expandidos (BX) e blastocistos eclodidos (BE). A partir do modelo PLS-DA foram determinadas variáveis de importância na projeção (VIPs) em cada grupo de estudo. O PLS-DA gerou uma lista de 15 íons VIP para cada uma das análises em cada estágio de desenvolvimento. Por fim, para verificar a eficácia do teste de classificação, foi utilizada uma curva de características operacionais do receptor (ROC). A acurácia preditiva foi de 80% para o grupo geral de embriões, 87% para BL, 68% para BX e 79% para BE (P< 0,05). Para os três estágios de desenvolvimento, prosseguiu-se com a atribuição dos íons com base em seus valores de massa utilizando o banco de dados HMDB 5.0 (Human Metabolome Database). Para uma maior compreensão foi realizado o estudo de rotas metabólicas utilizando o MetaboAnalyst 5.0. Os resultados indicaram 09 vias significativamente (P<0.1) ativadas com base nos metabólitos identificados. No grupo de fêmeas, predominaram as rotas da pentose fosfato, fosfato de inositol, efeito Warburg e pirimidina, já no grupo de machos, destacaram- se as rotas da vitamina B6 e aspartato indicando perfis distintos entre os grupos reflexo de suas diferenças fisiológicas, especialmente no metabolismo energético. A análise da curva ROC mostrou boa acurácia para os estágios BL e BE dos embriões, mas a complexidade do painel requer desenvolvimento de um algoritmo para aprimorar a predição, considerando o estágio embrionário. Embriões zebuínos machos e fêmeas mostraram diferenças significativas na produção de metabólitos.