Caracterização citogenética de linhagens de milho (Zea mays L.) através de bandamento cromossômico e hibridação molecular in situ - Bertão, Mônica Rosa (1998)
O presente estudo foi realizado como parte de uma linha de pesquisa desenvolvida no Departamento de Genética, ESALQ/USP, visando a caracterização citogenética de linhagens endogâmicas, envolvendo as metodologias de bandamento-C e hibridação molecular in situ. Foram realizados experimentos para a padronização de um protocolo para a obtenção de preparações citológicas com alto índice de metáfases de boa qualidade, com cromossomos bem espalhados e com a morfologia dos cromossomos bem nítida, utilizando-se pré-tratamento com inibidores do fuso mitótico e da síntese de proteínas. O pré-tratamento empregando uma combinação de 8- hidroxiquinolina a 0,03% e cicloheximida a 0,00125% promoveu maior acúmulo de metáfases e prometáfases em comparação ao tratamento com 8-hidroxiquinolina a 0,03%. As lâminas foram preparadas através de esmagamento das células meristemáticas após tratamento enzimático (com celulase e pectinase) da raiz e dissecção da mesma para remoção das células meristemáticas. Foi realizada uma análise biométrica dos cromossomos somáticos em preparações coradas pela metodologia de bandamento-C, de duas linhagens com diferenças em seu conteúdo de knobs heterocromáticos e respectivo híbrido. Foram constatadas novas evidências de que bandas-C correspondentes a knobs de tamanho grande ou médio (observados no paquíteno) alteram o tamanho dos braços de cromossomos somáticos, conforme observação anterior (Aguiar-Perecin & Vosa, 1985). A análise comparativa entre cromossomos mitóticos e cromossomos paquitênicos evidenciou nítida correspondência entre os valores de comprimento relativo e relação de braços para a maioria dos cromossomos, além de demonstrar claramente a correspondência entre as bandas-C e os knobs heterocromáticos. Durante o desenvolvimento do presente trabalho foi padronizado um protocolo para hibridação molecular in situ. através do método de marcação não isotópica da sonda de DNA com biotina e detecção do sinal de hibridação através de digestão enzimática, empregando-se fosfatase alcalina conjugada com avidina/ estreptavidina. Foi utilizada uma sonda da sequência de DNA altamente repetitivo de 185 pb, característica dos knobs heterocromáticos, para a investigação do padrão de distribuição destas sequências ao longo dos cromossomos. O material utilizado foi o híbrido 441123 x 4443. O sinal de hibridação da sonda de DNA de 185 pb apresentou estreita correspondência com a localização e tamanho das bandas-C. A eficiência da presente metodologia pode ser amplamente explorada para o mapeamento de diversos tipos de sequências de DNA ao longo do complemento cromossômico nesta espécie e em outras espécies vegetais.