Filogenia e taxonomia de tripanossomas de vertebrados aquáticos. - Fermino, Bruno Rafael (2018)
Flagelados do gênero Trypanosoma são parasitas obrigatórios de todas as classes de vertebrados e estão divididos em duas linhagens filogenéticas principais: o clado terrestre, composto por tripanossomas de mamíferos, serpentes, lagartos, crocodilianos e aves, e o clado aquático, que contém tripanossomas de sanguessugas e de vertebrados aquáticos (peixes) ou semiaquáticos (quelônios, anuros e ornitorrinco). Pouco se sabe sobre a diversidade, relações filogenéticas e filogeografia de tripanossomas que infectam hospedeiros não mamíferos. Neste trabalho, analisamos vertebrados aquáticos e semi-aquáticos com o objetivo de avaliar a prevalência e a diversidade de tripanossomas que parasitam esses hospedeiros. Foram utilizadas sequências dos genes gGAPDH e SSU rRNA para inferências filogenéticas e levantamentos de tripanossomas em amostras de sangue de crocodilianos (sul-americanos e africanos), peixes e tartarugas com o objetivo de identificar possíveis vetores, do trato digestivo de tabanídeos e sanguessugas. Tripanossomas de crocodilianos e tabanídeos foram obtidos por hemocultura. Comportamento in vitro (formas em cultura), morfologia e características ultraestruturais complementam a descrição molecular de novas espécies definidas em análises filogenéticas. Inicialmente, tripanossomas que parasitam jacarés neotropicais foram identificados em Caiman crocodilos, C. yacare, Melanosuchus niger e Paleosuchus trigonatus da Amazônia, Pantanal e Cerrado. Inferências filogenéticas foram realizadas visando: a) avaliar a relação entre os hospedeiros e a geografia na diversidade e relações filogenéticas dos tripanossomas de crocodilianos; b) formular hipóteses biogeográficas consistentes com as histórias evolutivas dos tripanossomas, bem como de seus hospedeiros crocodilianos. As análises revelaram um clado exclusivo de tripanossomas de crocodilianos, posicionado no clado terrestre e composto por 4 subclados: 1) subclado (Africano) que compreende Trypanosoma gray de C. niloticus e moscas tsé-tsé; 2) subclado de tripanossomas de jacarés, representado por Trypanosoma ralphi n. sp. de M. niger, C. crocodilus e C. yacare de diferentes bacias hidrográficas brasileiras; 3) subclado formado por Trypanosoma terena n. sp. de C. yacare, compartilhando hospedeiros e bacias hidrográficas com T. ralphi e incluindo tripanossomas de C. crocodilus do rio Orinoco (Venezuela) e do crocodilo africano O. tetraspis; 4) subclado (Cay03) representado por tripanossomas de C. crocodilus e M. niger da Amazônia. A estreita relação filogenética entre tripanossomas sul-americanos e africanos é consistente com a recente dispersão transoceânica do gênero Crocodylus durante o Mioceno/Plioceno (4-5 Ma) e com tripanossomas trocando de hospedeiros durante a configuração geológica das bacias hidrográficas sulamericanas, moldando, assim, as histórias evolutivas dos crocodilianos e de seus tripanossomas. Um levantamento realizado por PCR e sequenciamento em amostras de sangue de jacarés e de sanguessugas coletadas nestes animais revelou novos tripanossomas e infecções mistas frequentes. Análises filogenéticas revelaram uma nova espécie posicionada no clado aquático (Trypanosoma clandestinus n. sp.), próxima aos tripanossomas de peixes e detectada em C. yacare, C. crocodilus e M. niger do Pantanal e Amazônia. Um grande número de epimastigotas em divisão e tripomastigotas longos e delgados foram encontrados no tubo digestivo de sanguessugas (Haementeria sp.) removidas da cavidade oral de jacarés, apresentando sequências idênticas às determinadas em T. clandestinus. Infestação experimental de jacarés jovens com sanguessugas infectadas resultou em infecções prolongadas que nos permitiram delinear o ciclo de vida de T. clandestinus, que, até o momento, é a primeira espécie de tripanossoma de crocodilianos transmitida por sanguessugas e posicionada no clado aquático, relacionada com tripanossomas de peixes. A fim de investigar possíveis vetores de tripanossomas de crocodilianos neotropicais, examinamos tabanídeos coletados enquanto se alimentavam de jacarés e os resultados revelaram alta prevalência de insetos positivos para tripanossomas. Análises filogenéticas de sequências obtidas a partir do trato digestivo desses tabanídeos revelaram a presença de T. terena, T. ralphi e duas novas espécies do clado terrestre, enquanto que T. clandestinus não foi detectado. Uma nova espécie de tripanossoma de crocodilo, T. kaiowa n. sp., apresentando características comportamentais e morfológicas únicas, foi obtida em cultura a partir de tabanídeos e sangue de jacarés. Enquanto a maioria dos tabanídeos apresentou infecções mistas (65%), um deles, albergando exclusivamente T. kaiowa n. sp, foi usado para estudar o desenvolvimento no vetor e delinear o ciclo de vida desse tripanossoma. Portanto, nossos 11 dados mostraram que os jacarés podem albergar tripanossomas dos clados aquático (transmitidos por sanguessugas) e terrestre (tabanídeos), muitas vezes simultaneamente. Este trabalho também investigou a prevalência e a diversidade dos tripanossomas de peixes, amplamente distribuídos e altamente prevalentes em peixes de água doce e marinhos, incluindo teleósteos e elasmobrânquios. Anteriormente a este estudo, todas as espécies de tripanossomas de peixes da América do Sul foram identificadas com base em parâmetros não confiáveis como morfologia e hospedeiro de origem. Este é o primeiro estudo que realizou análises filogenéticas (complementadas por dados morfológicos) de tripanossomas de peixes sul-americanos (brasileiros) e de sanguessugas retiradas de peixes. Apesar de divergências relevantes, as análises agruparam todos os tripanossomas de peixes brasileiros e das respectivas sanguessugas em um único clado. Tripanossomas encontrados no sangue de peixes e em sanguessugas revelaram-se altamente pleomórficos, o que é consistente com a divergência de sequências, sugerindo que muitas espécies infectam peixes, muitas vezes em infecções mistas. Filogenias moleculares e a morfologia desses tripanossomas foram usadas para descrever duas novas espécies. Trypanosoma abeli n. sp. é a primeira espécie de peixe da América do Sul a ser isolada em cultura, posicionada em árvores filogenéticas e caracterizada a nível de ultra-estrutura. Trata-se de espécie altamente prevalente em Hypostomus luetkeni e H. affinis (cascudos do bioma Atlântico), sendo também encontrada in cascudos da Amazonia e Pantanal. A segunda espécie de tripanossoma de peixe descrita no presente estudo é Trypanosoma sp. (traíra), detectada em Hoplias malabaricus e em sanguessuga do gênero Haementeria, e caracterizada por PCR-sequenciamento e morfologia em esfregaços sanguíneos de peixes e intestino de sanguessugas encontradas no Pantanal e na Amazônia. Os levantamentos por PCR-sequenciamento demonstraram que peixes e sanguessugas (que albergam tripanossomas de peixes, tartarugas e jacarés) geralmente apresentam infecções mistas. Nossos resultados fortemente suportam grandes distâncias genéticas que separam os tripanossomas de peixes Neotropicais (que incluem clados exclusivamente de cascudo e traíra) dos peixes da Europa, América do Norte e África. De fato, os tripanossomas de peixes Neotropicais estão mais relacionados ao tripanossoma Neotropical T. clandestinus (jacarés) e a tripanossomas de quelônios. As análises filogenéticas de tripanossomas de tartarugas Neotropicais (espécies aquáticas dos gêneros Mesoclemmys e Podcnemis) e jabutis (espécies terrestres do gênero Chelonoidis spp.), comparada com tripanossomas de tartarugas da África (Trypanosoma mocambicum de Pelusios sp.) e Austrália (Trypanosoma chelodina) revelaram que: 1) todos os tripanossomas de quelônios, independentemente se de tartarugas de água doce ou jabutis, agruparam no clado aquático, exibindo complexas relações com tripanossomas de peixes, jacarés e ornitorrinco; 2) grandes distâncias genéticas separam os tripanossomas Neotropicais e Afro-tropicais de quelônios. Em um cenário evolutivo plausível, as relações filogenéticas entre tripanossomas de peixes, tartarugas e jacarés estão mais relacionadas à origem geográfica do que às relações filogenéticas com seus hospedeiros vertebrados. Muito provavelmente, um tripanossoma ancestral comum diversificou e adaptou-se a diferentes vertebrados, possivelmente mediante troca de hospedeiro mediada por sanguessugas aquáticas que se alimentam de todos esses hospedeiros.