Interações com membranas de peptídeos de fusão da glicoproteína S do SARS-CoV - Basso, Luis Guilherme Mansor (2014)
O presente trabalho tem como objetivo geral a consolidação dos esforços iniciados anteriormente em nosso grupo para a utilização de marcação de spin sítio dirigida aliada à técnica de ressonância magnética eletrônica pulsada, em particular, ressonância dupla elétron-elétron (DEER), para medidas de distâncias entre sondas inseridas em moléculas biológicas. Como objetivo específico, interessa-nos a obtenção de informações estruturais de dois peptídeos pertencentes ao domínio de fusão da glicoproteína Spike do coronavírus causador da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS) quando de sua ligação em modelos de membranas biológicas. Valemos-nos de uma abordagem conjunta envolvendo técnicas espectroscópicas, calorimétricas e computacionais para monitorarmos mudanças conformacionais nos peptídeos, suas conformações mais representativas e seus efeitos sobre a estrutura das membranas modelo. Os experimentos de calorimetria mostraram que os peptídeos perturbam fortemente o comportamento termotrópico de vesículas constituídas por fosfolipídios zwiteriônicos e negativamente carregados, sendo o efeito mais significativo na presença de lipídios negativos. Não somente a carga, mas também a estrutura da cabeça polar dos lipídios parece ter contribuição importante para a energética da interação. Os experimentos de dicroísmo circular mostraram que os peptídeos possuem alta flexibilidade conformacional, adotando diferentes estruturas secundárias em ambientes diversos. Uma mistura de conformações do SARSFP coexiste em solução aquosa e nos modelos de membranas, sugerindo alta plasticidade estrutural. Este peptídeo possui, ainda, alta capacidade de auto-associação e forma estruturas β e/ou agregados β regulares. Já o peptídeo SARSIFP adquire estrutura predominantemente α-helicoidal em micelas, estruturas β em lipossomos e conformações irregulares em água. Em particular, este peptídeo parece se ligar às membranas na forma de α-hélices, mas adquirir estruturas β em alta concentração. A flexibilidade conformacional dos peptídeos também foi estudada por dinâmica molecular (DM). Hélices, estruturas β, voltas, dobras e estruturas irregulares são visitadas durante as trajetórias dos dois peptídeos, mas o SARSIFP apresenta menor flexibilidade estrutural. O perfil de energia livre apresentado consiste de uma superfície plana, larga e rasa, sem grandes barreiras energéticas separando os diferentes estados conformacionais. A energia térmica à 300 K é suficiente para visitar boa parte do espaço conformacional acessível aos peptídeos ao longo dos parâmetros de ordem escolhidos. Por fim, obtivemos informações estruturais de análogos paramagnéticos dos peptídeos duplamente marcados com radicais nitróxidos quando em diferentes solventes e miméticos de membranas, além de estudarmos a oligomerização de derivados unicamente marcados. As distribuições de distâncias recuperadas dos sinais de DEER mostram que o SARSIFP adota primariamente α-hélices na presença dos miméticos, com provável formação de estruturas β na presença de micelas negativas. Para o SARSFP, uma larga distribuição de distâncias foi encontrada em todos os miméticos de membranas, refletindo a coexistência de conformações provavelmente bem compactas. Análogos unicamente marcados dos peptídeos ainda revelaram alta capacidade de formação de oligômeros em SDS-d25. Os resultados obtidos com esse conjunto de técnicas permitiram avanços consideráveis sobre as conformações adotadas pelos peptídeos nas diversas situações, o que pode revelar informações importantes acerca dos passos iniciais do mecanismo de fusão com membranas da glicoproteína Spike do coronavírus causador da SARS.