Estudos estruturais e correlação com a síndrome urolitíase de mutantes da adenina fosforribosiltransferase humana - Pimenta Junior, Alécio Antonio (2011)
A 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento.