Construção de bibliotecas de cDNA com com pcr de baixa estringência e primers híbridos e clonagem e uma apirase de Schistosoma mansoni - Fietto, Juliana Lopes Rangel (2001)
Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends).