Caracterização de glicosil hidrolases envolvidas na degradação de biomassa vegetal - Melo, Vandierly Sampaio de (2022)
Em virtude da crescente demanda por energia e de problemas ambientais causados pelo consumo de combustíveis fósseis, tem-se aumentado a necessidade de produção de combustíveis renováveis. O etanol de segunda geração (2G) surgiu como uma alternativa promissora aos combustíveis fósseis devido ao uso de biomassa vegetal como matéria-prima. Para que haja o processo de hidrólise enzimática da biomassa vegetal e obtenção de açúcares fermentáveis é fundamental o uso de diversas enzimas, tais como endo-&#945-1,5-L-arabinanases e &#946-xilosidases. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo caracterizar as enzimas glicosil hidrolases endo-&#945-1,5-L-arabinanase e &#946-xilosidase de Geobacillus sp. JS12 e Geobacillus thermodenitrificans, respectivamente. Os genes das enzimas putativas, endo-&#945-1,5-L-arabinanase (GeoARA) e &#946-xilosidase (GeoXIL) foram obtidos a partir de análises da base de dados CAZy e posteriormente sintetizados e clonados para a expressão das proteínas recombinantes em E. coli BL21. Análises de bioinformática foram realizadas da sequência de aminoácidos da GeoARA e GeoXIL. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de níquel-sefarose e realizou-se a caracterização bioquímica e análises de termoestabilidade por dicroísmo circular. As enzimas GeoARA e GeoXIL foram agrupadas dentro da família de glicosil hidrolases 43 (GH43). A partir dos testes de atividade, notou-se que a GeoARA possui maior atividade em pH 7,0 e temperatura de 70 °C, enquanto a GeoXIL possui maior atividade em pH 5,0 e temperatura de 60 °C. Nos testes com íons metálicos e EDTA, ambas as enzimas foram estáveis. Verificou-se que a GeoARA possui uma boa estabilidade térmica em 70 °C, principalmente na presença do íon Co2+ após 48 horas, enquanto que a GeoXIL apresentou maior estabilidade a 50 °C por 4 horas. A GeoARA possui uma significativa atividade sobre a arabinana desramificada (226,67 U/mg) e eficiência catalítica de 53 mL/mg/s. Por sua vez, a GeoXIL apresentou atividade bifuncional de &#946-xilosidase e &#945- L-arabinofuranosidase, com maior atividade sobre o substrato p-nitrofenil-&#946-D-xilopiranosídeo. A atividade específica sobre o p-nitrofenil-&#946-D-xilopiranosídeo foi de 18,33 U/mg e eficiência catalítica de 20,21 /mM/s; comparável com outras &#946-xilosidases. A atividade em elevadas temperaturas, termoestabilidade e estabilidade a íons metálicos são características desejáveis a enzimas industriais. Nesse sentido, as enzimas GeoARA e GeoXIL apresentam características bioquímicas interessantes para aplicação na hidrólise enzimática de biomassa vegetal