Efeito da proteína p53 nas respostas celulares à terapia fotodinâmica com 1,9-dimetil azul de metileno - Abrantes, Aline Bianca de Paiva (2017)
A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento que utiliza um fotossensibilizador, luz e oxigênio para gerar espécies reativas de oxigênio capazes de induzir a morte de células indesejadas, como tumores e micro-organismos infecciosos. Nosso foco está na morte induzida por 1,9-dimetil azul de metileno fotoativado (TFD-DMMB). Este fotossensibilizador foi previamente estudado por nosso grupo. Foi mostrado que o DMMB se acumula em lisossomos e mitocôndrias, e danifica essas organelas após fotoativado. O DMMB em concentração nanomolar promove uma morte celular eficiente, que parece ser resultante do bloqueio da conclusão do processo autofágico, enquanto outros fotossensibilizadores geralmente são empregados na faixa de micromolar. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar o mecanismo molecular da TFD-DMMB através do estudo do papel da proteína p53 nas respostas celulares à TFD-DMMB. Sendo uma proteína supressora tumoral, p53 participa de vários processos celulares em resposta a diferentes estresses. Para atingir nosso objetivo, utilizamos linhagens celulares HEK293T que expressam diferentes quantidades de p53, sendo uma linhagem knockdown para p53 (HEK293T-p53KD) e outra com expressão normal de p53 (HEK293T-SC, scramble). Após o tratamento com DMMB fotoativado, avaliamos a fototoxicidade, apoptose, dano no DNA, ciclo celular e autofagia. Nossos resultados mostram que, apesar de não observarmos a estabilização de p53, a TFDDMMB parece induzir a localização citoplasmática de p53, sugerindo que p53 citoplasmática participa da resposta celular à TFD-DMMB. A linhagem HEK293T-p53KD mostrou-se menos sensível à TFD-DMMB. Essa diferença foi explicada pelo acúmulo de células em sub- G1, indicativo de morte por apoptose, apenas na linhagem HEK293T-SC, que foi mais sensível ao tratamento. É possível que a atividade citoplasmática de p53 esteja relacionada com a indução de apoptose no nosso modelo. Em contraste aos efeitos de p53 na morte celular, encontramos respostas à TFD-DMMB independentes de p53 na parada do ciclo celular e autofagia. Observamos acúmulo de células na fase S do ciclo celular associado à fosforilação de CHK1 e H2AX, indicativo da ocorrência de estresse replicativo. A relação com a autofagia foi confirmada pelo acúmulo de vesículas ácidas e aumento dos níveis proteicos de LC3-II. Esses resultados indicam a indução ou o bloqueio da autofagia, entretanto não observamos um aumento simultâneo nos níveis de BECLIN-1, proteína importante para a iniciação da autofagia. Além disso, DMMB fotoativado resultou em dano seletivo no DNA mitocondrial (mtDNA), que não foi reparado em 24 horas. Desse modo, e baseado nos resultados preliminares do nosso grupo, propomos que a morte celular induzida por DMMB fotoativado é decorrente principalmente do bloqueio da resolução da via autofágica, comprometendo a eliminação de mitocôndrias danificadas e levando a alterações na dinâmica do ciclo celular. Nossos resultados sugerem que há respostas celulares à TFDDMMB dependentes e independentes de p53. Resultados similares foram obtidos para a linhagem HEK293, que é a linhagem parental de HEK293T. Do nosso conhecimento, a relocalização de p53 para o citoplasma, a habilidade em induzir dano seletivo no mtDNA e o bloqueio da progressão do ciclo celular na fase S são resultados inéditos decorrentes da TFDDMMB. O dano seletivo ao mtDNA torna o DMMB um modelo útil para estudos de mecanismos de resposta a dano no DNA específicos para a mitocôndria.