Silenciamento gênico do BMPRII em células da granulosa bovinas - Castro, Fernanda Cavallari de (2014)
As células da granulosa (CG) são constituintes do ambiente folicular de suma importância para o desenvolvimento, maturação e aquisição da competência oocitária, desempenhando funções como a esteroidogênese, expressão de receptores de LH (LHR) e síntese de inúmeras proteínas essenciais. Contudo, a funcionalidade e ação destas células são dependentes de alguns fatores derivados do oócito, como o GDF9 e o BMP15. A ação desses fatores, por sua vez, depende da sinalização via receptor BMPRII, já identificado em células da granulosa de mamíferos, porém com suas funções ainda pouco conhecidas na espécie bovina. O silenciamento gênico por lipofecção consiste num método de transfecção eficiente e pouco agressivo para as células, representando uma importante ferramenta para o estudo funcional de genes e proteínas celulares. O objetivo do presente trabalho foi, primeiramente, otimizar as condições de lipofecção em CG bovinas e, a partir desse protocolo, estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico para o BMPRII usando a técnica de RNA de interferência, a fim de possibilitar a futura utilização de tal estratégia como ferramenta para o estudo funcional do BMPRII e outros genes de interesse. Para tanto, no primeiro experimento referente à otimização das condições de lipofecção em CG bovinas, onde as células da granulosa, obtidas de ovários oriundos de abatedouro foram tratadas com diferentes quantidades dos lipofectores Lipofectamine® RNAiMAX (1, 2 e 3µl) ou Lipofectamine™ 2000 (1, 2 e 3µl) e dos indicadores de transfecção siGLO® (30, 50, 75 e 100nM) ou plasmídeo transgênico FUGW (100, 200, 300, 400, 600 e 900 nM) durante 24 e 48 horas de cultivo. A melhor eficiência de lipofecção foi observada às 24 horas de cultivo com 2µl de Lipofectamine™ 2000 + 100nM de siGLO®. Num segundo experimento, a partir das condições de lipofecção determinadas, foram testadas diferentes concentrações do siBMPRII (0 a 500 pmol) durante 24 h de cultivo. Ao final desse período, as células de cada grupo foram avaliadas quanto à abundância relativa mRNA BMPRII por PCR em tempo real. Todas as concentrações resultaram em uma redução semelhante de transcritos, sendo possível adotar a menor concentração (100 pM), a qual foi utilizada para determinar o tempo mínimo de cultivo necessário para obter eficiência no processo de silenciamento. As células foram tratadas por 0, 6, 12, 18 e 24 h e também avaliadas quanto aos transcritos de BMPRII. Os tempos de incubação que proporcionaram maior redução do mRNA para o BMPRII foram 18 e 24 horas. A melhor concentração e tempo de incubação com o siRNA foram avaliados por Western Blotting, confirmando a redução da expressão de BMPRII também em nível de proteína. Em conclusão, este trabalho possibilitou o estabelecimento de uma metodologia eficiente para o silenciamento gênico por lipofecção do BMPRII em CG bovinas, a qual poderá ser utilizada como ferramenta para o estudo funcional de diversos genes de interesse.