Investigação de facetas pró e antioxidantes de flavoproteínas de Xylella fastidiosa - Pimenta, Marcela Valente (2012)
As flavoproteinas AhpF (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade F) e TrxR (Tiorredoxina Redutase) sao membros da familia piridina dissulfeto redutase e possuem atividade dissulfeto redutase as custas de NAD(P)H. A proteina TrxR e responsavel pela reducao de Tiorredoxina (Trx) que participa do ciclo catalitico de grande parte das enzimas da familia peroxirredoxina, alem de outras enzimas. AhpF e dedicada a reducao de AhpC, (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade C) uma peroxirredoxina exclusiva de bacterias, AhpC e AhpF juntas formam sistema AhpR (Alquil Hidroperoxido Redutase). AhpF possui dois dominios, Trx-like (N-terminal) e TrxR-like (C-terminal); sendo que a ultima possui alta similaridade de estrutura e sequencia a TrxR. De forma interessante AhpF possui atividade NADH-oxidase formadora de H2O2, enquanto TrxR nao possui. Provavelmente pequenas mudancas na sua estrutura contribuem para essa diferenca. A atividade NADH-oxidase esta presente em algumas flavoproteinas e esta geralmente centrada no anel de isoaloxazina do cofator FAD. Este anel quando no estado radicalar e chamado de semiquinona. A semiquinona pode estar protonada ou desprotonada, sendo que a ultima forma e relacionada com atividades oxidase e oxigenase de maneira geral, mas ainda nao existem regras claras a respeito da reatividade de flavoproteinas com o oxigenio. Para elucidar quais poderiam ser essas diferencas, nos clonamos os genes para as proteinas TrxR, AhpC e AhpF da bacteria fitopatogenica Xylella fastidiosa e os expressamos em Escherichia coli. Reconstituimos com sucesso o sistema AhpR in vitro, medindo o consumo de H2O2 na presenca de AhpC, AhpF e NADH atraves de eletrodos especificos para peroxido. Da mesma forma caracterizamos a atividade NADH-oxidase de AhpF medindo o consumo de oxigenio e a producao de peroxido de hidrogenio. Alem disso, demonstramos que a atividade NAD(P)H-oxidase e ausente em TrxR atraves de ensaios de consumo de NADH. A expressao de somente o dominio C-terminal de AhpF manteve a atividade NADH-oxidase como na proteina selvagem, levando a crer que sao diferencas no motivo TrxR-like que disparam a atividade NADH-oxidase. Analisando a sobreposicao de estruturas tridimensionais de AhpF e TrxR disponiveis no PDB em conjunto com o alinhamento de sequencia de aminoacidos destas proteinas em diferentes organismos, identificamos tres possiveis candidatos que poderiam estar envolvidos na atividade NADH-oxidase. Atraves de mutacao sitio dirigida, identificamos que a retirada do residuo de histidina entre o motivo CXXC de AhpF fez o mutante AhpF H347T apresentar metade da atividade especifica NADHoxidase. Da mesma forma a mutacao reversa em TrxR, adicionando o residuo de histidina no motivo CXXC levou a TrxR T142H apresentar uma atividade especifica significativamente maior que a TrxR selvagem. Os dados em conjunto sugerem que o residuo de histidina por sua natureza polar e relevante para a desprotonacao do anel de izoaloxazina do FAD, e a sua consequente reatividade com o oxigenio, sendo um fator importante para a atividade NADH-oxidase presente em AhpF