Avaliação da autofagia como mecanismo limitante da eficiência terapêutica de inibidores farmacológicos de FLT3 em leucemia mieloide aguda - Melo, Manuela Albuquerque de (2023)
Mutações no gene FLT3 atingem cerca de 30% dos pacientes com leucemia mieloide aguda (LMA), sendo a FLT3-ITD a mais frequente e relacionada a um pior prognóstico. O desenvolvimento de inibidores de FLT3 representou um avanço no tratamento da LMA, pois reduzem a proliferação celular e melhoram a sobrevida dos pacientes. Contudo, a limitação clínica no tratamento da LMA com mutação FLT3 representa uma oportunidade de investigar combinações de fármacos que resultem em melhores resultados terapêuticos. O presente estudo, portanto, tem como objetivo investigar se inibidores de FLT3 induzem autofagia e se a terapia combinada com inibidores da autofagia potencializam o efeito anti-leucêmico dos inibidores de FLT3. Para tanto, investigamos, por meio de análise de dados públicos de expressão gênica, e análises de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA), os efeitos do tratamento ex vivo com midostaurin e quizartinib em células primárias de pacientes com LMA. Para avaliar autofagia decorrente do tratamento com inibidores de FLT3, as linhagens celulares com mutação FLT3-ITD MOLM13 (homozigose) e MV4-11 (heterozigose) foram tratadas in vitro por 48 horas com inibidor de FLT3 de primeira ou segunda geração (midostaurin, na dose de 12.5 nM e quizartinib na dose de 1.25 nM, respectivamente); a autofagia foi visualizada através de microscopia óptica (coloração panótica), microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (ambas pela detecção da sonda celular de livre-permeabilização laranja de acridina) e os mecanismos moleculares da indução da autofagia foi realizada por meio da análise de expressão proteica por Western Blotting. Para avaliar os efeitos anti-leucêmicos decorrente do tratamento com fármacos inibidores de FLT3 e de autofagia, as linhagens celulares e as células primárias foram tratadas por 48 horas com midostaurin na dose de 12.5 nM e quizartinib na dose de 1.25 nM combinados ou não com a inibição farmacológica (cloroquina na dose de 5 µM) ou genética (silenciamento gênico de ATG5 através de partículas lentivirais) da autofagia e a sobrevida celular foi avaliada a partir de ensaios de viabilidade (metiltiazoltetrazólio), proliferação (anti-Ki-67 humano) e morte celular (Anexina V). Para comparação entre variáveis contínuas em grupos categóricos foi utilizado o teste ANOVA e o pós-teste de Bonferroni. Observamos o enriquecimento de genes da autofagia em pacientes com LMA e mutação em FLT3 que responderam mal ao tratamento ex vivo com midostaurin e quizartinib (p<0,05). Em linhagens celulares de LMA com mutação FLT3 (MOLM13 e MV4-11), o tratamento in vitro com inibidores de FLT3 aumentou a vacuolização citoplasmática e a formação de autofagolisossomos (p<0,05). A análise de expressão proteica permitiu observar que o tratamento com midostaurin e quizartinib induziu autofagia a partir da degradação da proteína p62 e da conversão da proteína LC3B-I em LC3B-II com posterior degradação de LC3B-II, e a indução da autofagia foi mediada por meio da inibição da via de sinalização PI3K-AKT-mTOR. A combinação de inibidor de FLT3 com a inibição genética ou farmacológica da autofagia potencializou o efeito antineoplásico dos inibidores de FLT3 demonstrado por meio da redução da viabilidade celular (p<0,05) e do aumento da apoptose celular (p<0,05) comparado com a monoterapia com inibidores de FLT3. Contudo, a inibição da autofagia não demonstrou alterar a capacidade de proliferação celular (p>0,05). O tratamento combinado de midostaurin ou quizartinib com a cloroquina reduziu a viabilidade e aumentou a apoptose em células de paciente com LMA com mutação FLT3-ITD, mas não em paciente com LMA com FLT3-WT. Em conclusão, em células de LMA com mutação FLT3, os inibidores de FLT3 de primeira ou segunda geração induzem autofagia, a autofagia representa um alvo terapêutico, e a inibição da autofagia pode, portanto, aumentar o efeito anti-leucêmico de inibidores de FLT3.