Obtenção de peptidases heterólogas do fungo filamentoso Rhizomucor miehei a partir de análise do transcriptoma - Martins, Júlia Raspante (2021)
Enzimas são proteínas catalizadoras amplamente utilizadas em diferentes tipos de indústrias, sendo as de origem microbiana as mais comuns. Os microrganismos possuem grande diversidade genética o que os tornam fontes promissoras para pesquisa e identificação de enzimas com o potencial biotecnológico. O fungo termofílico Rhizomucor miehei é conhecido por produzir hidrolases com potencial de aplicação industrial, sobretudo as subclasses lipases e peptidases. A aplicabilidade das novas peptidases é influenciada pela caracterização funcional e por fatores que contribuem e modulam sua estabilidade térmica. Este trabalho apresenta ensaios de atividade enzimática do filtrado de cultura de R. miehei, construção e análise do seu transcriptoma, análises in silico de duas de suas peptidases e expressão das últimas em Pichia pastoris. O cultivo submerso do fungo foi realizado em um meio suplementado com quatro fontes orgânicas complexas (celulose microcristalina, azeite, caseína e farinha de pena) que atuam como indutores da produção de enzimas despolimerizantes. O filtrado de cultura, obtido a partir dos cultivos, foi utilizado para determinação da atividade enzimática de peptidases, lipases, amilases, endoglucanases, xilanases e lacases. A massa micelial, também proveniente dos cultivos, foi destinada à extração de RNA para sequenciamento e construção do transcriptoma. Foi detectado atividade hidrolítica de peptidases, amilases e lipases, com perfis diferentes em relação à suplementação do meio de cultivo, evidenciando o potencial das enzimas secretadas pelo fungo. No sequenciamento, foram obtidas 69080 sequências de transcrição e, dessas sequências, quase 70% tiveram correspondência com proteínas revisadas do UniProtKB. Entre as sequências anotadas, aproximadamente um terço são hidrolases, sendo 404 peptidases diferentes. Foram selecionadas duas sequências do transcriptoma que codificam uma aspártico peptidase e uma carboxipeptidase, com base na anotação funcional, para análise do potencial biotecnológico in silico e expressão heteróloga. A clonagem, expressão heteróloga e purificação da aspártico peptidase mostrou-se factível enquanto para a carboxipeptidase, apesar de ter sido devidamente clonada, não foi possível detectar expressão no meio extracelular.