Aplicabilidade da reação em cadeia da polimerase digital em gotas e do sequenciamento paralelo em larga escala no diagnóstico genético da Síndrome de McCune-Albright - Bastianelli, Aline Guimarães de Faria (2024)
Contexto: A síndrome de McCune-Albright (SMA) é uma doença rara caracterizada por displasia fibrosa óssea (DFO), manchas café-au-lait e hiperfunções endócrinas, causada por mutação ativadora pós-zigótica no códon 201 do gene GNAS, que codifica a subunidade alfa da proteína G estimulatória (Gs). As mutações missenses mais comuns (95% dos casos) decorrem da substituição de uma arginina por cisteína ou histidina (p.R201C/H). As mutações pós-zigóticas no gene GNAS são adquiridas em estágios precoces da embriogênese, resultando em um estado de mosaicismo somático. Devido a essa particularidade, o número de células afetadas varia dependendo do momento em que a mutação ocorre. Portanto, A SMA apresenta um amplo espectro fenotípico, que pode acarretar subdiagnóstico em quadros clínicos mais brandos. Consequentemente, técnicas que permitam a identificação da mutação no DNA de sangue periférico são altamente desejáveis, pois evitariam procedimentos invasivos para obtenção de amostras de tecidos, além da confirmação do defeito genético representar um grande avanço no diagnóstico, acompanhamento e manejo terapêutico dos pacientes portadores da SMA. Neste contexto, as técnicas de droplet digital PCR (ddPCR) e de sequenciamento paralelo em larga escala (SPLE), emergiram como metodologias mais sensíveis para a identificação de mutações em mosaico. Objetivos: Pesquisar a mutação p.R201C/H no gene GNAS em DNA de leucócitos periféricos pela técnica de ddPCR. Comparar a técnica da ddPCR com o SPLE nos pacientes que foram submetidos ao painel de genes relacionados às endocrinopatias (que inclui o GNAS) da Disciplina de Endocrinologia da Faculdade de Medicina da USP ou sequenciamento exômico global (WES). Métodos: A caracterização clínica e genética de 64 pacientes foi realizada, sendo 53 pacientes de uma coorte brasileira e 11 pacientes de uma coorte espanhola. Foram incluídos pacientes com diagnóstico clínico da SMA (portadores de pelo duas características clínicas da SMA) e pacientes com 1 característica clínica da SMA (puberdade precoce periférica - PPP ou DFO). Todos os pacientes foram submetidos à análise genética por ddPCR e 35 dos 64 pacientes por SPLE. Resultados: A tríade clínica da SMA foi identificada em 34,4% (22/64) dos pacientes, enquanto 2 e 1 características clínicas estavam presentes em 34,4% (22/64) e 31,2% (20/64) dos pacientes, respectivamente. A PPP foi a endocrinopatia mais prevalente, presente em 59,4% dos pacientes. A ddPCR identificou a mutação p.R201C/H em 45,3 % (29/64) dos pacientes, sendo 25 pacientes portadores de SMA e 4 pacientes com 1 característica clínica (3 pacientes portadores de PPP e 1 de DFO). Houve associação entre o número das características clínicas e o resultado genético positivo (p=0,0154). A mediana da abundância fracional detectada na ddPCR foi 0,58 (IQ 0,16; 1,7), variando de 0,1% a 14,8%. Não houve diferença entre as medianas das taxas de abundância fracional e o número de manifestações clínicas da SMA (p=0,07). O SPLE identificou a mutação p.R201C/H em 20% (7/35) dos pacientes, todos portadores da SMA (6 pacientes portadores da tríade clínica e 1 paciente portador de 2 características clínicas). A média da abundância fracional das mutações foi 8,7 ± 6 % e variou entre 2,9% e 19%. Não houve associação entre o número de características clínicas e o resultado genético positivo (p=0,075). Houve diferença significativa na proporção de resultados positivos e negativos comparando a ddPCR com o SPLE (45,3% vs 20%, p=0,002). Não houve diferença entre as médias das taxas de abundância fracional e o tipo de teste genético realizado (p=0,34). Conclusões: A ddPCR representou o método mais sensível na confirmação do diagnóstico genético da SMA em DNA de sangue periférico. Quanto maior o número de manifestações clínicas da SMA, maior foi a probabilidade de estabelecer o diagnóstico genético da SMA. Houve concordância entre os resultados das amostras testadas pelas duas metodologias. O diagnóstico genético da SMA foi estabelecido pela ddPCR em pacientes com apenas uma manifestação clínica da síndrome (SMA-like)