Modulação da mecânica do tecido pulmonar periférico e da resposta do estresse oxidativo pela inibição da arginase e da iNOS em modelo experimental de inflamação crônica pulmonar - Aristóteles, Luciana Ritha de Cassia Rolim Barbosa (2012)
Introdução: A importância do parênquima pulmonar na fisiopatologia da asma tem sido recentemente enfatizada, particularmente nos pacientes com asma grave e de difícil controle. O óxido nítrico (NO) é um importante modulador da resposta contrátil, inflamatória e de remodelamento pulmonar que ocorrem na asma. Embora seu papel na modulação em vias aéreas proximais e distais já tenha sido estabelecido, seus efeitos no parênquima pulmonar foram pouco investigados. Objetivos: Avaliar se a inibição da arginase 2, por intermédio do tratamento com N-hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA), e da iNOS, por intermédio da administração de 1400W, pode modular a resposta constritora de parênquima distal, o estresse oxidativo, a expressão de iNOS, assim como a atividade da arginase, em modelo de inflamação alérgica crônica pulmonar em cobaias. Métodos: Os animais foram expostos a sete inalações com soro fisiológico ou com ovoalbumina em doses crescentes (1~5mg/ml- 4 semanas) e tratados com 1400W (2mg/Kg ip. diariamente) iniciando após a 7ª inalação e nor- NOHA (10M - infusão no banho durante a avaliação da mecânica oscilatória), ou associação de 1400W + nor-NOHA (administrado conforme descrito anteriormente). Setenta e duas horas após a sétima inalação os animais foram anestesiados, exsanguinados e a foi realizada a avaliação da mecânica oscilatória do parênquima pulmonar, sendo obtidos os valores de resistência e elastância tecidual na condição basal e após desafio (0,1% de ovoalbumina). Em seguida, os fragmentos de tecido pulmonar periférico foram fixados em solução de formolaldeído a 4%, por 48 horas. Depois de terminada a fixação, o material foi submetido às técnicas histológicas habituais com parafina, para obtenção de cortes de 4m de espessura. Os cortes foram corados para Hematoxilina e Eosina e utilizando técnica de imunohistoquímica foram avaliados o número de células iNOS positivas, a expressão de PGF2, do fator de transcrição NF-kB e de arginase 2 no septo alveolar, por intermédio de avaliação morfométrica. A expressão de arginase 2, NF-kB e PGF2 nos fragmentos de tecido pulmonar periférico foram avaliados em aumento 400X utilizando o programa Image-Pro Plus 4.5v Image Analysis System e os resultados foram expressos em porcentagem. Em relação ao número de células iNOS positivas nos fragmentos pulmonares, foi utilizada a técnica de contagem de pontos, determinada pelo número de pontos que coincidiam em células positivas em cada campo dividido pelo número de pontos que incidiam no tecido pulmonar, no aumento de 1000x. Foram analisados 10 campos por corte, selecionados de forma randômica. Os resultados foram expressos como células por unidade de área (104m2). Para a avaliação da atividade da arginase 2, foi utilizado o método descrito no kit da BioAssay Systems que utiliza um cromogênio, que forma um complexo corado com uréia, produzido na reação de arginase. A determinação da atividade da arginase 2 envolveu a medida da velocidade de reação, expressa em termos de atividade por miligrama de proteína (U/mg). Resultados: Não houve alteração no percentual de estruturas (vasos, vias aéreas e tecido alveolar) no tecido pulmonar nos quatro grupos experimentais, sendo que mais de 90% de tecido do fragmento pulmonar foi constituído de alvéolos. Os animais que foram expostos à ovoalbumina apresentaram um aumento da resistência e da elastância tecidual (após desafio antigênico), no número de células iNOS positivas, na percentagem de expressão de PGF2, arginase 2 e NF-kB no septo alveolar, assim como da atividade de arginase 2 comparativamente aos grupos controles (p<0,001). O tratamento com nor-NOHA ou 1400W isoladamente em animais expostos à ovoalbumina atenuou a resposta de elastância e resistência teciduais após desafio antigênico (p<0,001), o número de células iNOS positivas (p<0,001), na expressão de PGF2, de arginase 2 e NF-kB no septo alveolar (p<0,001). Porém a atividade da arginase 2 só foi reduzida nos grupos que foram tratados com nor-NOHA e na associação de 1400W e nor-NOHA (p<0,05). A associação de 1400W e nor-NOHA em animais expostos à ovoalbumina potencializou a atenuação da expressão PGF2 no septo alveolar (p<0,001). Conclusões: O presente estudo sugere que, neste modelo experimental de inflamação crônica pulmonar, a inibição da arginase tem papel importante na modulação das repostas constritoras e de estresse oxidativo no parênquima pulmonar distal. A associação da inibição da iNOS à da arginase 2 potencializa o controle da resposta de estresse oxidativo. Estas respostas são, pelo menos em parte, moduladas pela ativação de NF-kB. A inibição destas vias enzimáticas pode representar uma estratégia futura para o tratamento de pacientes com asma grave e de difícil controle