Análise da Expressão Gênica Durante a Diferenciação Osteogênica de Células Mesenquimais Estromais de Medula Óssea de Pacientes Portadores de Osteogênese Imperfeita - Kaneto, Carla Martins (2011)
A osteogênese imperfeita (OI) é caracterizada como uma desordem genética na qual uma osteopenia generalizada leva a baixa estatura, fragilidade óssea excessiva e deformidades ósseas graves. As células mesenquimais estromais multipotentes (CTMs) são precursores presentes na medula óssea adulta capazes de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e mioblastos que passaram a ter grande importância como fonte terapia celular. O objetivo do presente estudo foi analisar o perfil de expressão gênica durante a diferenciação osteogênica a partir de células mesenquimais estromais multipotentes da medula óssea obtidas de pacientes diagnosticados com Osteogênese Imperfeita e de indivíduos controle. Foram coletadas amostras de três indivíduos normais e cinco amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita. As células mononucleares (CMN) foram isoladas para a obtenção de células mesenquimais que foram expandidas até a terceira passagem quando iniciou-se o estímulo para diferenciação osteogênica. Também foram realizadas análises para contagem de CFU-F e para quatro das cinco amostras de pacientes portadores de OI, o número de CFU-F observado foi inferior ao geralmente encontrado para amostras de doadores normais. Foram coletadas células para análises de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo e o RNA foi extraído originando a amostra denominada T0. As garrafas restantes tiveram suas células estimuladas para diferenciação osteogênica. Após um dia em cultura com estímulo, mais uma garrafa teve o RNA de suas células extraído (T1), e o mesmo procedimento foi realizado nos dias 2 (T2), 7 (T7), 12 (T12), 17 (T17) e 21 (T21). Todas as amostras demonstraram possuir potencial de diferenciação in vitro em osteoblastos e adipócitos. A imunofenotipagem de células mesenquimais foi realizada e as amostras de todos os pacientes apresentaram perfil imunofenotípico compatível com trabalhos anteriores. Foram identificadas mutações nos genes COL1A1 e/ou COL1A2 responsáveis pelo desenvolvimento da doença para quatro dos cinco pacientes avaliados. Para o paciente portador de Osteogênese Imperfeita e Síndrome de Bruck a região codificadora do gene PLOD2 também foi seqüenciada, porém não foram encontradas mutações. A análise da expressão gênica foi realizada pela técnica de microarranjos e foram identificados vários genes com expressão diferencial. Alguns genes com importância fundamental na diferenciação osteoblástica apresentaram menor expressão nas amostras dos pacientes portadores de OI, sugerindo um menor comprometimento das CTMs desses pacientes com a linhagem osteogênica. Outros genes também tiveram sua expressão diferencial confirmada por PCR em Tempo Real. Foi observado um aumento na expressão de genes relacionados a adipócitos, sugerindo um aumento da diferenciação adipogênica em detrimento à diferenciação osteogênica. A expressão das variantes do gene PLOD2 mostrou-se diferencial entre amostras normais, de OI e do paciente portador de Síndrome de Bruck. Também foi evidenciada uma expressão diferencial do microRNA 29b, um microRNA com papel estabelecido durante a diferenciação osteogênica, sugerindo um mecanismo de regulação dependente da quantidade de RNAm do seu gene alvo, o COL1A1.