Estudo de patogenicidade de duas cepas de Neospora caninum isoladas de caprinos e sua correlação genética com outras cepas por genotipagem de microssatélites - Costa, Rafael Carneiro (2020)
O presente trabalho compreende o Estudo de diferentes cepas de Neospora caninum do Brasil e da Escócia quanto às suas características genéticas, avaliação de patogenicidade, virulência e possibilidade de isolamento. O primeiro capítulo, consiste de um artigo publicado no periódico internacional Veterinary Parasitology e descreve uma tentativa de isolamento de cepas do parasito utilizando tecido placentário de cabras naturalmente infectadas, em um bioensaio utilizando gerbis. Apesar dos gerbis serem descritos na literatura como sendo altamente susceptíveis à infecção por N.caninum, somente foi obtido sucesso na infecção de animais após imunossupressão com altas doses de metilpredinisolona. Animais imunossuprimidos apresentaram sinais clínicos de emagrecimento, pelos arrepiados e alterações de propriocepção como Head tilt. Análises histopatológicas revelaram reações inflamatórias no encéfalo, consistindo de infiltrados inflamatórios mononucleares multifocais associados à manguitos perivasculares e estruturas parasitárias semelhantes a cistos e taquizoítos, juntamente com áreas de necrose associadas à infiltrado inflamatório de macrófagos e reação de cicatrização em musculatura esquelética. Apesar do sucesso na infecção dos gerbis, não foi possível obter o isolamento do parasito em cultivo celular em uma primeira tentativa, o que levou à segunda parte do trabalho. O capítulo dois consiste de um artigo publicado no periódico intenracional Experimental Parasitology. Foram utilizados tecidos dos gerbis infectados descritos anteriormente e novas amostras de sistema nervoso central de caprinos naturalmente infectados em um bioensaio em camundongos C57BL6 Knockout para o gene Interferon gamma (camundongos knockout- KO). Os camundongos Knockout por serem incapazes de desenvolver uma resposta imune adequada ao N.caninum, permitiram a rápida replicação de taquizoítos principalmente em macrófagos peritoneais, os camundongos apresentaram acentuada perde de peso, letargia e ascite 15 a 30 dias após inoculação, quando foram eutanasiados e o líquido peritoneal utilizado para infecção de monocamadas de células VERO. A grande quantidade de taquizoítos no líquido peritoneal de camundongos KO permitiu uma rápida adaptação e crescimento dos mesmos em cultura de células, dando origem a dois isolados de cabras nomeados NC-Goat1 e NC-Goat2. Os dois isolados foram testados quanto à sua Patogenicidade em um modelo de infecção experimental em camundongos BALB/c, amplamente utilizado na literatura. As cepas não apresentaram alta patogenicidade e virulência no modelo de infecção de camundongos, apesar das duas cepas terem sido associadas a doença clínica em caprinos, com abortos, natimortos e encefalite em caprinos jovens e adultos. O terceiro capítulo apresenta resultados de um estudo genético de genotipagem dos isolados NC-Goat1 e NC-Goat2, amostras clínicas de caprinos e bovinos do sul de Minas Gerais e amostras de bovinos da região de Dumfries e Galloway na Escócia. Utilizando a técnica de genotipagem por microssatélites, análises filogenéticas evidenciaram que as cepas de N.caninum presentes nos isolados e nas amostras clínicas de caprinos tinha relação próxima com os isolados brasileiros NC-SP1, NC-Bahia e NC-Goiás, enquanto que as amostras de bovinos de minas gerais não se correlacionaram proximamente às outras. Analisando as amostras provenientes de rebanhos escoceses, todos tenderam a se relacionar proximamente entre elas e com outras amostras escocesas descritas anteriormente na literatura. Análises adicionais utilizando marcadores microssatélites descritos pelo grupo de pesquisa do Instituto Moredun, evidenciaram genótipos mistos associados ao isolado padrão de N. caninum (NC-1), sugerindo que o isolado poderia ter sido composto por múltiplos genótipos ao isolamento e à medida que foi replicado em cultura celular convergiu em uma população mais homogênea de parasitos.