Papel da serinoprotease Sat na patogênese da sepse causada por Escherichia coli. - Freire, Claudia Andrade (2021)
As Escherichia coli extraintestinais (ExPEC) fazem parte da microbiota intestinal humana, mas podem causar doença ao acessar um sítio extraintestinal. Este patógeno é um dos principais causadores das infecções de corrente sanguínea (ICS), uma vez que utiliza diversas estratégias para evasão dos mecanismos da imunidade inata encontrados no sangue, como o sistema complemento. Dentre elas, destacam-se dois membros da família das Serino Proteases Autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATEs), denominadas Pic e EspP, cujas ações proteolíticas sobre o complemento já foram demonstradas. Porém, altas frequência do gene sat (que codifica a SPATE Sat) têm sido detectadas em cepas de E. coli isoladas de bacteremia, fato que sugere o envolvimento desta SPATE na patogênese das ICS. Sat já foi caracterizada quanto à sua ação citotóxica sobre diferentes linhagens celulares, incluindo células endoteliais, mas sua possível ação imunomodulatória ainda não foi investigada. Diante dessas evidências, o presente trabalho se propôs a avaliar o papel de Sat na patogênese das ICS e da sepse causada por E. coli. Inicialmente, uma coleção de 278 cepas de E. coli isoladas de bacteremia humana foi analisada quanto a presença de 12 genes que codificam SPATEs (eatA, epeA, espC, espI, espP, pet, pic, sat, sepA, sigA, tsh e vat). Dentre eles, sat foi o mais frequente, sendo detectado em 34,2% das cepas. Para continuidade do trabalho, a cepa EC071 foi selecionada desta coleção por não possuir outros genes que codificam SPATEs além de sat. Seu genoma foi sequenciado e a presença de outros genes relacionados à resistência ação bactericida do complemento, como genes de proteínas de membrana externa (ompTc, ompTp e ompX) e a protease Prc foram detectados. Ensaios de resistência à ação bactericida do soro humano normal mostraram que a cepa EC071 resiste a essa atividade. A protease Sat foi purificada em sua forma nativa a partir do sobrenadante de cultura da cepa EC071 e utilizada em ensaios proteolíticos contra as proteínas do sistema complemento. As proteínas C2, C3, C3b, C4, C4b, C5, C6, C7, C8 e C9 foram clivados por Sat e essas clivagens foram inibidas por fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), um inibidor de serinoproteases. Um mutante em sat e mutantes complementados com o gene funcional ou não funcional foram obtidos a partir da EC071 e avaliados quanto a resistência à ação bactericida do soro. No entanto, não houve diferença significativa no fenótipo apresentado pelas construções em relação a cepa selvagem, indicando que Sat não é o único fator responsável por este fenótipo. Em um modelo murino de sepse, observou-se a redução de 50% nas mortes dos animais infectados pela cepa mutante em relação aos infectados pela cepa selvagem e a complementação de Sat funcional na cepa mutante restaurou parcialmente o efeito observado na cepa selvagem. Os resultados aqui apresentados mostram que Sat está envolvida no estabelecimento das ICS e da sepse e que, além de desempenhar efeitos citotóxicos, pode conferir também proteção contra o sistema imune do hospedeiro por meio da clivagem direta de proteínas do sistema complemento.