Determinação do proteoma diferencial de células de carrapato em resposta à infecção por Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa - Martins, Larissa Almeida (2018)
A febre maculosa das Montanhas Rochosas, conhecida no Brasil como febre maculosa brasileira (FMB), é a riquetsiose mais grave que acomete o homem. A doença é causada por Rickettsia rickettsii, uma -proteobactéria intracelular obrigatória transmitida pela picada de diferentes espécies de carrapatos. Apesar das altas taxas de letalidade da FMB, sua profilaxia baseia-se exclusivamente na prática de se evitar o contato com os carrapatos vetores. Neste contexto, a identificação e caracterização das proteínas envolvidas nas interações entre R. rickettsii e carrapatos é importante, podendo auxiliar na identificação de potenciais alvos para o controle da doença. Para isso, o uso de um sistema in vitro (linhagem celular) é fundamental, pois permite que análises sejam realizadas ao longo da infecção e com um maior controle das condições experimentais que os experimentos in vivo, além de não envolver o uso de animais vertebrados. Assim, o objetivo geral desse projeto de pesquisa foi identificar o conjunto de proteínas (proteoma) de células do carrapato Rhipicephalus microplus (linhagem BME26) infectadas ou não por R. rickettsii. As proteínas extraídas de células BME26 em um ponto inicial da (6 h) e na fase exponencial de crescimento bacteriano (48 h) foram processadas e analisadas por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas in tandem (LC-MS/MS). Como controle, as proteínas extraídas de células não infectadas nos pontos de 6 e 48 h foram igualmente processadas e analisadas. Um total de 1.119 proteínas foram identificadas, das quais 1.111 correspondem a proteínas de carrapatos e apenas oito a proteínas de bactérias, as quais foram desconsideradas das análises subsequentes. Após 6 h de infecção, 163 proteínas de foram induzidas e 159 foram reprimidas. Em 48 h, 95 proteínas foram induzidas e 65 foram reprimidas. Dentre as proteínas moduladas em resposta à infecção por R. rickettsii, proteínas de regulação negativa de apoptose foram reprimidas no ponto de 6 h e induzidas no ponto de 48 h. A apoptose é um processo de morte celular programada, o qual é ativado por diferentes estímulos, inclusive por infecções. Após o reconhecimento do estímulo, uma série de fatores são ativados, incluindo as enzimas-chave do processo, denominadas caspases, culminando na morte celular. Como o sistema imune de artrópode é mais simples que o sistema imune de vertebrados, a apoptose é um mecanismo importante de controle das infecções. Dessa forma, avaliamos a fragmentação de DNA genômico (DNAg) e a exposição de fosfatidilserina na face externa da membrana plasmática, duas características típicas de células em apoptose, e a atividade de caspase 3 em células BME26 infectadas ou não por R. rickettsii. A fragmentação de DNAg foi observado apenas nas células não infectadas após 96 h. Além disso, a atividade da caspase-3 foi significativamente menor em células infectadas em relação ao controle. Em contrapartida, a inibição da atividade da caspase-3 não foi observada quando as células foram estimuladas com riquétsias termo-inativadas, sugerindo que fatores produzidos por R. rickettsii sejam necessários para esse efeito. A exposição de fosfadidilserina também foi pronunciadamente maior em células infectadas do que em células não infectadas ou estimuladas com bactérias termo-inativadas. A inibição química da apoptose com Z-DEVD-Fmk, inibidor de caspase-3, favoreceu o crescimento de R. rickettsii em células BME26. Por outro lado, o tratamento com estaurosporina, um ativador clássico da apoptose, inibiu o crescimento bacteriano. Em conjunto, os dados mostram que o processo de apoptose em células BME26 é controlado por R. rickettsii, o que é importante para a sua proliferação. Esse é o primeiro relato sobre a inibição da apoptose em células de carrapatos por bactérias do gênero Rickettsia. Estudos futuros deverão ser realizados para identificar as proteínas de R. rickettsii, bem como de seus carrapatos vetores, envolvidas no controle da apoptose, podendo auxiliar numa melhor compreensão da interação vetor-patógeno.