Estabelecimento de protocolo de cultura de tecidos e transformação genética para três genótipos de Lemnoideae - Oliveira, Juliana Helena Veríssimo de (2021)
As lentilhas dágua (Lemnaceae), também conhecidas como \"duckweeds\", são pequenas monocotiledoneas aquáticas que se dividem em duas subfamilias: Lemnoideae e Wolffioideae. Essas espécies possuem diversas cararcteristicas de interesse agronômico, aquanômico e ecológico sendo as principais delas: rápida multiplicação de suas pequenas folhas, denominadas frondes; seu alto valor nutricional e proteico; sua capacidade de remoção de resíduos e fitorremediação do local onde habitam; suas aplicações farmacológicas e biotecnológicas; e a possibilidade de produção em larga escala em biorreatores. Devido às suas qualidades, essas plantas vem sendo estudadas para serem introduzidas em protocolos de cultura de tecidos, permitindo assim a manipulação genética. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer protocolos de cultura de tecidos para três genótipos de Lemnoideae: 8627 e DWC124, da espécie Lemna minor, e 7498 da espécie Spirodela polyrhiza. Neste estudo, foram conduzidos experimentos para obtenção de indução de calos, regeneração de plantas, testes de resistência de frondes a antibiótico, regeneração de plantas a partir de calos na presença de antibióticos e também a transformação genética de calos do genótipo 8627 de Lemna minor via Agrobacterium tumefaciens com o vetor pCAMBIA2301. Este vetor expressa o genes uidA que codifica a proteína β-glucuronidase - GUS e o nptII que confere resistência à canamicina. O tratamento que melhor permitiu indução de calos para os três genótipos estudados, foi o com adição de 0,25 mg.L-1 de 2,4-D e 1 mg.L-1 de TDZ ao meio de cultivo MS na condição de escuro e a partir de frondes inteiras (intactas). Para regeneração de plantas, o meio de cultivo MS diluído, e o tratamento com adição de 0,2 mg.L-1 de BAP, foram os mais eficientes em promover a regeneração de novas folhas a partir dos calos. Para o genótipo 8627 de L. minor, calos com idade entre 120 e 130 dias, ou entre 140 e 150 dias, foram os que apresentaram maior taxa de regeneração, de 88%. Para o genótipo DWC124 de L. minor, calos com idade entre 120 e 130 dias promoveram um a taxa de 74% de regeneração. E os calos do genótipo 7498 de S. polyrhiza, apresentaram 44% de regeneração a partir de calos com idades entre 45 e 55 dias ou entre 85 e 95 dias. A partir dos resultados dos experimentos de resistência a antibióticos, onde se foram testadas diferentes concentraçoes de canamicina, espectinomicina, estreptomicina, geneticina, tobramicina e timentin, pode-se definir quais concentrações se mostraram letais para cada um dos três genótipos e quais permitiram o crescimento de cerca de 50% das plantas, concentração ideal para ser utilizada em seleção de plantas em experimentos de transformação. A transformação genética de calos do genótipo 8627 de L. minor resultou na eficiência de 82,2 % de expressão transiente do GUS em calos e somente 2,7% nas frondes. Pode-se então induzir calos nos três genótipos, regenerar plantas a partir desses, e transformar de maneira transiente calos de L. minor 8627.