Expressão, caracterização e avaliação funcional de anticorpos humanos antitetânicos - Takata, Daniela Yumi (2021)
Tétano é uma doença neuromuscular causada exclusivamente pela ação da exotoxina produzida pelo Clostridium tetani (C. tetani). Apesar da existência de uma vacina segura e de baixo custo, a incidência e mortalidade do tétano ainda são preocupantes. Por isso, em casos com risco de tétano, a imunização passiva com soro contendo anticorpos antitetânicos equinos (SAT) ou com imunoglobulina humana hiperimune antitetânica (IGHAT) é utilizada. Em busca de terapia baseada na biotecnologia moderna, nosso grupo obteve anteriormente anticorpos monoclonais (mAbs) humanos antitetânicos derivados de linfócitos B isolados por single cell sorting. O objetivo deste trabalho foi ampliar e avaliar o painel de mAbs antitetânicos, visando a proposta de candidatos promissores para um futuro uso na terapia. O painel de mAbs foi testado por ELISA e Western Blot e inibição à ligação da toxina tetânica (TeNT) ao GT1b. Cinco mAbs foram analisados em microarray para identificar seus epítopos, e em ensaio de neutralização da toxina in vivo, individualmente ou associados em dois ou três. Somente uma mistura de três mAbs que se ligam a diferentes domínios da TeNT foi neutralizante, demonstrando a importância do sinergismo para a ação neutralizante. A fim de diminuir o uso de animais, alguns testes foram realizados como forma de tentar triar os anticorpos a serem testados in vivo. Porém, a execução dos testes foi limitada pela baixa concentração dos mAbs expressos e disponibilidade de TeNT, além de outras limitações dos ensaios. Devido à dificuldade em analisar um painel grande de anticorpos, decidimos nos dedicar à obtenção de uma linhagem permanente de expressão dos mAb que neutralizaram a toxina tetânica in vivo. Foi, então, encomendada a síntese de vetores já contendo sequências para a expressão das regiões constantes das cadeias pesada gama 1 e leve kappa humanas. Realizamos também a compra de vetores com as sequências otimizadas das regiões variáveis de dois mAbs para comparação com as sequências geradas no laboratório. Houve diferença entre a produtividade dos mAbs obtidos com sequências otimizadas e sequências originais. Porém, como esperado, a otimização das sequências não alterou a função dos mAbs.