Estudos da estabilidade conformacional da tropomiosina e de suas interações com as outras proteínas do filamento fino - Holthauzen, Luis Marcelo Fernandes (2003)
Uma série de mutantes recombinantes da tropomiosina com a sonda fluorescente 5-hidroxitriptofano inserida em várias posições ao longo da seqüência primária vêm sendo utilizados em nosso laboratório para o estudo em nível molecular do controle do processo de contração muscular. Estes mutantes têm sido produzidos em cepas de bactéria auxotróficas para triptofano em meio mínimo ao qual adicionamos 5-hidroxitriptofano, um análogo do aminoácido triptofano. Esta sonda fluorescente apresenta a vantagem de absorver energia numa faixa de comprimentos de onda não absorvida pelo triptofano (temos usado com sucesso o comprimento de onda de 312 nm para excitar seletivamente o 5-hidroxitriptofano). Desta forma, o ambiente da sonda pode ser estudado em situações nas quais outras proteínas que possuam triptofanos, como, por exemplo a actina, estejam presentes. Procedemos a uma caracterização dos mutantes utilizados quanto à sua ligação à actina na ausência e presença de troponina (+/- Ca2+) e na presença de acrilamida por meio de ensaios de co-sedimentação com actina. O comportamento funcional dos diversos mutantes foi investigado pela análise da regulação da atividade Mg2+ -ATPásica da acto-S1 miosina destes mutantes na ausência e na presença de troponina (+/- Ca2+). Estudos da estabilidade destes mutantes da tropomiosina por meio de desnaturação por temperatura seguida por dicroísmo circular foram realizados para analisarmos o efeito das mutações na estabilidade global da molécula. Ensaios de desnaturação por uréia seguidas por fluorescência também foram realizados para analisarmos a estabilidade da molécula próxima à região da sonda fluorescente. O presente estudo compreendeu ainda a análise da supressão de fluorescência pelos supressores extrínsecos acrilamida e iodeto para diversos mutantes da tropomiosina na presença e ausência de outras proteínas do filamento fino, o que permitiu a obtenção de informações sobre o grau de exposição da sonda fluorescente nas diversas situações estudadas bem como sobre o ambiente eletrostático ao redor das sondas nestas diferentes situações. Estes resultados permitiram a obtenção de um modelo para a ligação da tropomiosina ao filamento de actina na presença de troponina (+/- Ca2+). Este modelo propõe que as bandas α do padrão de repetição α/β inicialmente proposto por Mclachlan e Stewart (1975 e 1976) se liguem ao filamento na ausência de íons cálcio. A introdução de cálcio no sistema é capaz de induzir uma rotação e um deslocamento na molécula de tropomiosina com relação ao filamento de actina. Nesta situação, seriam as bandas β da tropomiosina as responsáveis pela ligação desta molécula ao filamento de actina.