Caracterização dos efeitos de LPS em pinealócitos de rato em cultura - Armelin, Mara Andrade (2009)
A glândula pineal é um órgão transdutor da informação fótica ambiental para o meio interno do organismo, provendo melatonina para a circulação sistêmica, a qual sinaliza o período de escuro e sincroniza os ritmos endógenos de acordo com as variações ambientais (Reiter, 1993). Várias evidências apontam para uma comunicação bidirecional entre a pineal e o sistema imune. Foi identificado na glândula pineal de ratos o fator de transcrição NFkB, uma via de trasncrição preferencial para citocinas e glicocorticóides e que modula a síntese de melatonina. TNFα inibe transientemente enquanto corticosterona potencia a transcrição do gene da Aa-nat, enzima chave na síntese de melatonina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). LPS é um constituinte da membrana de bactérias gram-negativas e potente indutor de inflamação sistêmica e local. A sinalização de LPS é mediada por receptores toll-like 4 (TLR4) que leva à indução da enzima sintase de óxido nítrico induzivel (iNOS) e subsequente formação de óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi demonstrar a expressão de TLR4 e a resposta funcional da via de transdução de LPS. Foram usados ratos Wistar fêmeas (1-2 meses). O RNAm total foi extraído de pineais controle e usados em RT-PCR com primers específcos contra os transcritos tlr-4, Cd14 e o controle interno Gapdh. Para a imunohistoquímica, secções de pineal de animais perfundidos com solução fixadora seguida de fixação com PAF 4% foram usadas com o anticorpo contra TLR4, sendo o controle negativo obtido na ausência de anticorpo. Os pinealocitos foram obtidos por tripsinização seguida de dispersão mecânica. O acúmulo de NFkB em extratos nucleares de pineais de animais tratados in vivo com LPS (1 mg/kg, iv, 2h) foi analisado por EMSA. A produção de NO foi medida por microscopia confocal em células carregadas com o cromóforo fluorescente DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revelou a presence constitutiva do RNAm de tlr-4 e Cd14 em pineais de rato. O estudo imunohistoquímico indicou uma marcação positiva para TLR4 em localização citoplasmática e nuclear, sendo abolida qualquer marcação na ausência do anticorpo. Um aumento na translocação nuclear de NFB foi observada nos animais tratados com LPS. LPS também levou a uma resposta funcional com aumento na reatividade da iNOS e aumento na produção de NO de maneira dependente de tempo e da concentração de LPS (0,1 to 10 μg/mL). O máximo aumento da produção de NO foi observado com LPS 1 μg/mL por 2 h. Este efeito foi inibido com o pré-tratamento com L-NAME (0.1mM, 30min) e 1400W (1μM, 30 min). Estes resultados demonstram que a glândula pineal de rato está instrumentada a responder ao desafio com LPS através da indução da via NFkB mediada por TLR4. Além disso, funcionalmente esta estimulação induz um significante aumento da imunoreatividade à iNOS e produção de NO. Estes dados corroboram com a hipótese do eixo imune-pineal com supressão da produção de melatonina no início de uma resposta de defesa.