Desenvolvimento e investigação da transferência gênica de p14ARF e interferon-beta em linhagens celulares de melanoma humano - Mendonça, Samir Andrade (2018)
O melanoma é um dos tipos de câncer de pele cuja frequência tem crescido nos últimos anos e apresentado elevada taxa de mortalidade, apesar de ter reduzida prevalência. Mesmo havendo um considerável avanço nas propostas terapêuticas nos últimos anos, ainda se vê necessário o desenvolvimento de novas abordagens, sendo a terapia gênica uma promissora possibilidade para tal. Utilizando vetores adenovirais com promotor responsivo à p53 (PGTx beta) para a transferência gênica de p19Arf (proteína supressora de tumor) e interferon-beta (citocina imunomodulatória) em células de melanoma murino com o gene Trp53 selvagem, o nosso grupo demonstrou previamente que a combinação dos dois genes, mas não o tratamento individual, promove efeito citotóxico sinérgico com a liberação de marcadores de morte imunogênica, in vitro; e significativa redução da progressão tumoral acompanhada de uma forte resposta imunológica de linfócitos T CD4+ e CD8+, células NK e neutrófilos contra desafios tumorais, in vivo. Porém, como a translação para modelos de melanomas humanos ainda estava em estágio inicial, ainda não haviam sido confirmamos se esses benefícios também seriam recapitulados. Observações inicias sugeriam que apenas a transferência gênica de interferon-beta seja suficiente para induzir morte celular em linhagens humanas portadoras de TP53 selvagem, sem ainda terem sido identificado o efeito da transferência de p14ARF e nem a necessidade de p53 endógeno para a resposta. Dessa forma, o presente projeto buscou avaliar os efeitos antitumorais provocados pela terapia gênica combinada de p14ARF e interferon-beta em modelos de melanoma humano utilizando linhagens com e sem a via da p53 integra. Para isso, foram utilizadas diferentes linhagens celulares com TP53 selvagem ou com distintas mutações e também foram construídos vetores adenovirais com o promotor constitutivo CMV, tornando assim possível a expressão dos transgenes de maneira independente do status do TP53 endógeno. O presente trabalho revelou que a transferência combinada do interferon-beta e p14ARF revelou vantagem quanto ao estímulo citotóxico e regulação negativa na dinâmica da população em ambas as linhagens UACC-62 e SK-Mel-29, independentemente do estado da via da p53. Na avaliação dos mecanismos de morte foi observado que ambas a linhagens apresentaram marcação positiva para marcadores da via da apoptose, porém com possível participação de outras modalidades de morte-celular, como a necrose, para a linhagem com o TP53 mutado (SK-Mel-29). Além disso, mostramos que os tratamentos potencialmente induzem vias de morte com caráter imunogênico pela secreção de ATP e exposição da calreticulina, sendo este último marcador mais significantemente observado mediante o tratamento combinado. Assim, recapitulamos o benefício observado em modelo murino para a transferência gênica do interferon-beta e p14ARF em modelo de melanoma humano, e investigamos marcadores importantes à translação da proposta terapêutica para o melanoma