Estudos anatômicos da organogênese in vitro de soja e otimização do processo de transformação via Agrobacterium tumefaciens - Alves, Adriana Cristina (1999)
Com o objetivo de se determinar os tipos celulares capazes de originar gemas adventícias em soja [Glycine max (L.) Merrill], assim como a localização das áreas meristemáticas, estudou-se o processo de diferenciação in vitro através de análises anatômicas. Utilizando-se como explantes nós cotiledonares, excisados aos 14 dias após a germinação in vitro, foi observado que as áreas meristemáticas localizadas na superfície do explante são formadas pela rediferenciação de células da epiderme e das primeiras camadas do parênquima cortical, caracterizando sua origem exógena, sendo que as gemas adventícias formam-se diretamente sobre o tecido do explante. A utilização de BAP durante a germinação das sementes foi um pré-condicionamento para a formação das gemas. Neste estudo, também foram realizados ensaios para a otimização do processo de transformação via Agrobacterium. O emprego de ferimentos durante a inoculação da bactéria, visando alcançar células no interior do explante, não é necessário, uma vez que as células meristemáticas estão localizadas superficialmente e em processo ativo de divisão desde o início da cultura, fator importante na transformação genética. Doze variáveis foram avaliadas: adição e concentração de acetoseringona em meio de cultura e na cultura bacteriana, pH, temperatura, tempo de co-cultivo, meio de inoculação, concentração de células bacterianas, co-cultivo e pré-cultivo do explante na presença de 6-benzilaminopurina, linhagens bacterianas e ferimento no explante, totalizando 22 tratamentos. Os caracteres estudados foram número de explantes apresentando reação positiva para o teste GUS e número de pontos azuis. Os dados foram analisados segundo o teste estatístico de X2. Nenhum dos tratamentos apresentou mais do que 10% de explantes GUS positivos. Na maior parte dos tratamentos, 100% dos pontos azuis foram encontrados em regiões não meristemáticas, como epicótilos, cotilédones e base dos cotilédones. Em experimentos posteriores observou-se que o Agrobacterium comporta-se de maneira diferenciada conforme a combinação de pH e temperatura. Todas as combinações (linhagens AGLl, EHAI05 e GV2260; pH 5,0 e 5,8; temperaturas 25 e 28°C) foram acompanhadas de aumento na expressão do gene repórter em áreas meristemáticas. A localização histológica do produto da expressão do gene repórter uidA mostrou que esta ocorre em células da epiderme e do parênquima cortical, sendo estes os mesmos tipos celulares envolvidos na formação das gemas adventícias em nós cotiledonares de soja. Esta coincidência suporta a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de soja, utilizando-se como vetor o Agrobacterium tumefaciens.