Contribuição à exploração tecnológica dos estudos microbianos realizados no programa BIOTA FAPESP: avaliação do potencial da degradação anaeróbia de pentaclorofenol (PCP) em reator anaeróbio horizontal de leito fixo (RAHLF) - Saia, Flávia Talarico (2005)
O estudo que ora se apresenta integrou o conjunto de pesquisas do sub-projeto - Diversidade de Bactérias Associadas à Degradação de Compostos Recalcitrantes, do projeto temático BIOTA FAPESP - Ecologia Molecular e Taxonomia Polifásica de Bactérias de Interesse Ambiental e Agro-Industrial. Apresenta caráter inovador, na medida em que procurou avaliar o potencial de aplicação biotecnológica de microrganismos anaeróbios de uma área severamente contaminada no Brasil, o estuário de Santos-São Vicente, em degradar o pentaclorofenol (PCP). A pergunta fundamental a ser respondida pelos resultados experimentais realizados foi: são os microrganismos autóctones do estuário capazes de servirem de inóculo para degradar o pentaclorofenol em biorreatores sob condições metanogênicas? Dois grupos de amostras foram avaliados, o primeiro, uma parcela composta por vários sedimentos coletados no estuário e, o segundo, sedimentos coletados na região do Largo de Canéus e na frente da Companhia Siderúrgica Paulista (COSIPA). O estabelecimento da determinação cromatográfica do PCP e congêneres menos clorados para o monitoramento experimental mostrou que na análise da presença dos clorofenóis nos sedimentos, o método de extração por ultrassom com posterior metilação dos analitos foi adequado para concentração mínima de 200 'mü'g clorofenóis/Kg sedimento para 2,3; 2,6 diclorofenóis; 2,4,6 e 2,3,6 triclorofenóis. Contudo, não foi adequado para a determinação do PCP e 2,3,4 triclorofenol. Para o meio de cultivo, o método de extração do PCP por agitação em vórtex e acetilação dos analitos mostrou-se adequado para todos os clorofenóis e com limite de quantificação de 0,1 mg/L. A avaliação do potencial metanogênico foi realizada com as amostras compostas do estuário enriquecidas sob condições halofílicas. O valor estável de metano no biogás de 50% foi obtido nos primeiros 20 dias de incubação. O sedimento nessas condições foi utilizado como inóculo para fins de isolamento de culturas metanogênicas, redutoras do íon sulfato e degradadoras de PCP. Não foram obtidas culturas desalogenadoras; porém foram isoladas arquéias metanogênicas, cultivadas em metanol, acetato e formiato de sódio, bem como bactérias cultivadas em lactato de sódio na presença e ausência de sulfato de sódio. Ensaios fisiológicos aliados aos métodos moleculares FISH e DGGE permitiram identificar arquéias metanogênicas do gênero Methanosarcina sp. e microrganismos do domínio Bacteria. Os sedimentos individualmente estudados foram coletados com maior controle de anaerobiose empregando-se amostrador do tipo corer. O enriquecimento destes sedimentos, inicialmente sob concentração de 2,5 mg PCP/g STV e com adições periódicas de 50% da concentração inicial do clorofenol e 1,25 a 2,5 g/L de glicose por 13 meses a 30 graus Celsius, resultou na obtenção de culturas degradadoras do PCP sob anaerobiose estrita. Nos reatores controles sem PCP, já primeiros 20 dias de incubação 70% de metano foi determinado no biogás. Nos reatores com PCP, a produção do metano (20%) iniciou após 100 dias. A adsorção foi o principal mecanismo de remoção de 50% do PCP nas primeiras 12 horas de incubação dos enriquecimentos. Posteriormente, a redução do PCP no meio de 77% para a amostra de Canéus e 70% para a da COSIPA foi relacionada a mecanismos de biodegradação anaeróbia, como a desalogenação redutiva. Exames microscópicos mostraram a seleção de microrganismos na presença de PCP, com predomínio de bacilos formadores de esporos semelhantes ao gênero Clostridium sp., filamentos diversos e filamentos semelhantes as arquéias metanogênicas acetoclásticas relacionadas ao gênero Methanosaeta sp. O enriquecimento foi realizado sob condições halofílicas, segunda a salinidade de cada amostra estudada no estuário. Não houve perda do clorofenol por volatilização. Os resultados obtidos no enriquecimento anterior viabilizaram o estudo seguro do potencial anaeróbio dos microrganismos oriundos do sedimento da COSIPA em metabolizar o PCP em reator contínuo do tipo RAHLF. Assim, sedimento enriquecido sob condições metanogênicas e halofílicas foi inoculado no RAHLF, controlando-se rigorosamente a anaerobiose. O reator preenchido com cubos de espuma de poliuretana foi operado por 126 dias e tempo de detenção hidráulica de 18 horas, com meio de cultura salino contendo glicose (1 g/L) como principal fonte de carbono e PCP-Na nas concentrações de 5, 13, 15 e 21 mg/L. O desempenho do RAHLF foi estável com boa eficiência durante toda a operação. A redução dos níveis de matéria orgânica medida em DQO variou de 70 a 100% e a de PCP foi de 99%, com detecção de intermediários menos clorados e sob teores de metano no biogás de 20%. Da massa de 1111,73 mg de PCP aplicada no reator, 286,9 mg ficou retida no sistema pelo processo de adsorção nas biopartículas e 824,83 mg foi biodegradada. As análises morfológicas dos tipos celulares, em conjunto com as técnicas moleculares DGGE e FISH, revelaram a presença de grupos microbianos do domínio Archaea pertencente à família Methanosarcinacea e grupos do domínio Bacteria. A participação de grupos de domínio Bacteria, cuja estrutura dos tipos microbianos na comunidade variou ao longo do RAHLF e das concentrações de PCP, e dos organismos metanogênicos da família Methanosarcinacea, possibilitou responder a questão inicialmente formulada, uma vez que se pode afirmar que os microrganismos autóctones foram capazes de degradar o PCP sob condições metanogênicas e halofílicas, com eficiência adequada. A prática para a seleção dos microrganismos retirados do ambiente estuarino, de interesse para biotecnologia anaeróbia aplicada ao saneamento ambiental, que empregou o reator do tipo RAHLF, parece promissora para avanços da engenharia na remediação biológica de uma área cuja relevância é indiscutível para o estado de São Paulo