"Análise do gene PROP1 em pacientes com hipopituitarismo: estudo em DNA de células de mucosa oral e sangue periférico extraído com NaCI" - Abrão, Milena Garcia (2005)
As mutações no gene PROP1 são a causa genética mais comum da deficiência combinada de hormônios hipofisários. Até o momento, diversas mutações missense e pequenas deleções foram descritas sendo a mutação 301-302 delAG a mais freqüente. Nosso objetivo foi estudar as mutações em DNA de pacientes com hipopituitarismo e padronizar a extração de DNA de células de swab oral, usando um método com NaCl e comparar com um kit comercial (Purigene, Minneapolis, EUA). Amplificamos os 3 exons do gene PROP1 do DNA obtido de células orais e de sangue periférico. Identificamos a mutação 301-302delAG em 6 pacientes, 4 em homozigose (33%) e 2 em heterozigose (16%) e a mutação G51A em heterozigose em um único paciente. Em dois irmãos, filhos de pais consangüíneos, não foi possível amplificar os 3 exons do gene PROP1 enquanto que os os genes LHX3 e LHX4 foram amplificados com sucesso. Para confirmar a hipótese de deleção do PROP1, o Southern blotting foi realizado usando como sonda o produto de PCR do exon 2 do gene PROP1 e um fragmento do gene CYP21A2 como sonda controle. A banda referente ao CYP21A2 estava presente nos pacientes e nos controles enquanto a banda referente ao PROP1 estava ausente nos irmãos e presente na mãe e nos controles. Para definir a extensão da deleção usamos um mapa de STS próximos ao gene e o STS GDB:314805 localizado a 6,0 kb a montante do PROP1 não foi amplificado nos pacientes. Entretanto, o gene Q8N6H0 a 18 kb a juzante e o STS WI-16216 a 59 kb a montante do PROP1 foram amplificados com sucesso nos pacientes e controles indicando que a deleção está localizada dentro de 81 Kb. Para determinar os limites da deleção, várias reações de PCR foram realizadas com primers desenhados progressivamente distantes de gene PROP1, cobrindo toda a região. Isto nos permitiu determinar a região deletada de 9,6 kb a juzante e 11 kb a montante do gene PROP1, com o tamanho máximo deletado de 18,4 kb. Por ambos os métodos de extração obtivemos um DNA de boa qualidade, permitindo o amplificação dos 3 exons do gene PROP1. A extração com NaCl foi mais rápida e mais barata resultando em maior quantidade de DNA quando comparada com o kit comercial. Em conclusão, descrevemos a deleção completa do gene PROP1 em dois irmãos com o fenótipo clássico de hipopituitarismo associado à hipófise hipoplásica ou aumentada e padronizamos a extração de DNA de células de mucosa oral com NaCl, que apresentou custo mais baixo e resultado mais rápido quando comparado a extração por um kit comercial, indicando que o swab oral é uma fonte prática de obtenção de DNA para estudos genéticos.