Avaliação funcional do gene NANOG na segregação de linhagens celulares em embriões bovinos - Carreiro, Letícia Escobar (2022)
O desenvolvimento embrionário pré-implantacional é marcado pelos primeiros eventos de diferenciação celular em mamíferos. O primeiro evento de segregação celular consiste na separação entre a massa celular interna (MCI) e o trofectoderma (TE), enquanto a segunda diferenciação é o momento da separação entre epiblasto (EPI) e endoderma primitivo (PrE) dentro da MCI. Os mecanismos moleculares que controlam essa diferenciação envolvem a expressão temporal de fatores de transcrição específicos. Dados recentes indicam que o estudo do desenvolvimento embrionário inicial bovino seria um bom modelo para humanos. Sabe-se que, em camundongos, o fator de transcrição NANOG atua opostamente a outro fator de transcrição, GATA6 e as análises de expressão gênica agrupam populações celulares de forma que NANOG e GATA6 tornam-se mutuamente excludentes em EPI e PrE. O presente projeto procurou testar a hipótese de que NANOG é necessário para a especificação de EPI e repressão de PrE em embriões bovinos. Para tal, almejou-se realizar a deleção gênica de NANOG mediada por CRISPR/Cas9 em zigotos produzidos in vitro. Os grupos experimentais consistiram em zigotos microinjetados 8 ou 16 horas após a FIV com os RNA guias visando a deleção do gene NANOG em duas concentrações, 12,5 ou 80 ng/µl, e Cas9, sendo denominados Cas9-12,5 e Cas9-80, respectivamente, enquanto o grupo controle não foi microinjetado. Posteriormente os embriões foram cultivados para avaliação das taxas de clivagem, formação de blastocistos e desenvolvimento, análise da expressão proteica por imunofluorescência, análise de expressão gênica e genotipagem. Foi avaliada a expressão proteica de SOX17, um marcador de PrE por imunofluorescência, entretanto, nenhum dos blastocistos do grupo Cas9-12,5 apresentou a deleção esperada no gene NANOG. Foi observada uma diminuição importante da expressão de NANOG no grupo experimental Cas9-80 quando comparado ao grupo controle (p=0.0360), indicando que houve uma perturbação da expressão gênica, porém sem indícios de deleção total de NANOG nestas condições. As condições de tratamento do grupo Cas9-80, entretanto, não afetaram a expressão gênica de GATA6. Portanto, foi possível reduzir a expressão de NANOG com uso do sistema CRISPR em bovinos, sem alteração na formação de blastocistos e na expressão de GATA6, o qual tem relação com a diferenciação em PrE.