Avaliação in vitro da entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva através de vetores não virais. - Astudillo, Daniela Flores Teruya (2016)
Um dos principais limitantes ao desenvolvimento e aprovação para utilização em humanos das vacinas de DNA é a falta de um vetor ideal de entrega gênica, que seja ao mesmo tempo eficiente e seguro. Embora mais seguros, os vetores não virais enfrentam uma série de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a chegada do transgene ao núcleo das células alvo. Dando continuidade ao trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa, o principal objetivo desta dissertação de mestrado foi avaliar o desempenho do vetor não viral comercial Lipofectamina e da proteína multifuncional T-Rp3 na entrega do gene da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) a células BHK-21. Primeiramente, o gene RVGP foi inserido no plasmídeo modelo pVAX1. Foram então realizados estudos de transfecção em células BHK-21 (Baby Hamster Kidney), utilizando-se Lipofectamina como agente de transfecção, no sentido de constatar a correta expressão do gene RVGP contido no novo plasmídeo. Como controle positivo, foi utilizado o plasmídeo pCMV-RVGP. Os estudos de PCR quantitativo da transcrição reversa (qRT-PCR) e imunofluorescência indicaram a expressão da glicoproteína pelo pVAX1RVGP, ainda que em valores de expressão menores se comparados com o plasmídeo controle pCMV-RVGP. Foi também desenvolvido com sucesso um método quantitativo de determinação da expressão da RVGP em células utilizando-se citometria de fluxo, que confirmou os resultados anteriores. Devido ao plasmídeo pVAX1RVGP ter apresentado baixa eficiência de expressão da RVGP, buscou-se a elevação da eficiência a partir da adição da sequência de KOZAK no plasmídeo pVAX1RVGP. Nesse caso, ainda que os resultados indiquem um aumento na expressão, não houve confirmação estatística (p<0,05). Os estudos de entrega com a proteína T-Rp3 foram realizados com um lote da T-Rp3 armazenada em ultrafreezer. A proteína demonstrou-se não ser estável após o congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento em ultrafreezer pelo tempo de 10 meses. Apesar de ser capaz de complexar o pDNA após esse tempo, não foi eficiente em ensaios de transfecção, tendendo a agregar em relações molares altas e ausência de soro fetal bovino.