Correlação da estrutura-função das Anexinas A5 e A6 no processo de biomineralização - Veschi, Ekeveliny Amabile (2021)
O tecido ósseo é constituído pela combinação de uma matriz de colágeno e uma matriz mineral, que é formada por cristais de fosfato de cálcio, sob a estrutura de hidroxiapatita. Este processo de acúmulo de mineral no tecido ósseo é denominado biomineralização e é realizado por células chamadas osteoblastos, por intermédio da liberação de vesículas da matriz (MVs). Estas vesículas surgem por brotamento das superfícies das células e são secretadas no local específico do início da biomineralização na matriz do tecido ósseo. MVs contém altas concentrações de íon Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias várias proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições bastante particulares. Uma atenção especial deve ser dada a algumas proteínas presentes nas MVs: Anexina A5 (AnxA5) e Anexina A6 (AnxA6) e a Fosfatase Alcalina de tecido não especifica (TNAP). A AnxA6, foco de estudo desta tese, é o maior membro da família das anexinas presentes nas MVs, com aproximadamente 68 kDa. Análises bioquímicas revelaram que ela está presente em três regiões distintas nas MVs, indicando diversas funções durante o processo de mineralização. Buscamos neste estudo, compreender características e possíveis funções da AnxA6, comparando muitos de nossos achados com o que temos disponível na literatura em relação a AnxA5. O estudo revelou que em pH 6,5, 86% da estrutura da AnxA6 está na conformação α-hélice enquanto que a AnxA5 apresentou maior quantidade de α-hélice em pH 8 (~50%). Utilizando-se medidas de potencial zeta, foi possível determinar o ponto isoelétrico de 4,2 para a AnxA6. Os demais estudos foram realizados utilizando monocamadas e proteolipossomos composto de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) para mimetizar a lamela externa da bicamada de MV e eventualmente para imitar a lamela interna utilizou-se uma mistura de 9:1 DPPC:dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) com e sem Ca2+. Confirmamos que, de acordo com os dados bioquímicos, a AnxA6 interage de forma diferente com a membrana da MV. Análises termodinâmicas baseadas em medidas de pressão de exclusão superficial (πexc), entalpia (ΔH) e cooperatividade de transição de fase (ΔT1/2) mostraram que a AnxA6 interage com DPPC e 9:1 DPPC:DPPS, sendo que esta interação se tornou maior na presença de colesterol (Chol) (6:4 DPPC:Chol e 5:4:1 DPPC:Chol:DPPS). A interação AnxA6-lipídio também se mostrou Ca2+-dependente, conforme evidenciado pelo aumento na πexc em monocamadas carregadas negativamente de 9:1 DPPC:DPPS bem como, diminuição de ΔH em proteolipossomos desta composição lipídica causada pela adição da AnxA6 na presença de Ca2+ em comparação às bicamadas zwitteriônicas de DPPC. A interação da AnxA6 com DPPC e 9:1 DPPC:DPPS foi distinta mesmo na ausência de Ca2+, conforme observado por uma maior alteração nos valores de ΔT1/2 nas vesículas de 9:1 DPPC:DPPS em comparação com as vesículas DPPC. Imagens obtidas por microscopia de força atômica (AFM) revelaram protrusões na superfície dos proteolipossomos de DPPC e 5:4:1 DPPC:Chol:DPPS o que sugere que a AnxA6 oligomérica interagiu com a membrana das vesículas e que pode adotar conformações diferentes quando interage com a membrana lipídica. Estudos de mineralização in vitro foram realizados com a finalidade de verificar se a presença da AnxA6 (em solução ou associado a proteolipossomos) e Colágeno Tipo I levariam a propagação mineral. Foram utilizados como nucleadores o fosfato de cálcio amorfo (ACP) e sua forma mais estável associada à fosfatidilseria (PS-CPLX). Por meio de medidas de turbidez e análises de Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), verificou-se a AnxA6, em solução, e proteolipossomos com o nucleador PS-CPLX na ausência de colágeno tipo I, apresentaram melhores indícios de propagação mineral. A AnxA6 mostrou baixa capacidade de propagação de nucleação incorporada superficialmente em lipossomos, tal fato sugere que seu melhor desempenho seja na nucleação mineral.