Isolamento e caracterização de promotores de genes constitutivos de Citrus sinensis - Erpen, Lígia (2017)
A transformação genética é uma alternativa ao melhoramento convencional de citros que permite a modificação de genótipos pela introdução de um ou mais genes oriundos de organismos semelhantes ou filogeneticamente distantes do hospedeiro. Os genes transferidos para espécies de interesse devem ser controlados por promotores, os quais regulam a expressão gênica de forma temporal, espacial e na magnitude desejada. Na maioria dos casos, os genes são expressos de forma constitutiva utilizando o promotor CaMV35S isolado do Vírus do Mosaico da Couve Flor. No entanto, o desenvolvimento de novas abordagens de transformação de plantas (cisgenia e intragenia), que fazem o uso de genes e sequências regulatórias derivadas da mesma espécie ou espécies relacionadas, requer a disponibilidade de elementos genéticos, incluindo promotores constitutivos, isolados de citros. Assim, o objetivo do trabalho foi clonar e caracterizar promotores constitutivos de Citrus sinensis. Para isso, a região promotora dos genes Fator de elongação 1-α (CsEF1), Gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase C2 (CsGAPC2) e Cyclofilina (CsCYC) foi isolada e avaliados pela fusão ao gene repórter uidA. A funcionalidade dos três promotores foi confirmada por ensaio histoquímico da atividade GUS em folhas, caules e raízes de plantas transgênicas de citros cv. \'Hamlin\'. A análise de RT-qPCR mostra que a expressão do gene uidA sob controle dos promotores CsCYC, CsGAPC2 e CsEF1 correspondeu a uma atividade aproximada de 64%, 58% e 47%, respectivamente em comparação com o promotor CaMV35S. A análise in silico dos promotores CsGAPC2, CsCYC e CsEF1 mostra que a atividade de cada um é controlada por uma série de putativos elementos cis-regulatórios. A sequência completa e versões truncadas originadas a partir de deleções em cada promotor foram fundidas ao gene uidA e analisadas em plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana pelo ensaio histoquímico e fluorimétrico da atividade GUS. As análises de deleções não causaram perda de função dos promotores em estudo, mas afetaram a expressão gênica nos promotores CsGAPC2 e CsEF1. Os promotores isolados representam bons candidatos a serem utilizados em trabalhos de transformação genética de citros.