Análise molecular da comunidade bacteriana ativa nas infecções endodônticas - Nardello, Laura Cristina Leite (2022)
Introdução: Como as bactérias ativas apresentam uma maior abundância de RNA ribossômico (rRNA) do que DNA (genes rRNA), a razão rRNA/DNA foi utilizada para investigar bactérias ativas em infecções endodônticas. No 1o experimento, a razão rRNA/DNA do sequenciamento de próxima geração (NGS) foi empregada para investigar a comunidade endodôntica ativa. No 2o experimento, a razão rRNA/DNA de ensaios de qPCR foi utilizada para investigar a atividade de bactérias específicas, antes e após o preparo químico-cirúrgico (PQC). Adicionalmente, foi realizada uma revisão sistemática e meta-análise para investigar a prevalência de bactérias ainda não cultivadas/difíceis de cultivar em amostras pós-preparo. Métodos: Amostras endodônticas coletadas antes (S1) e após o PQC (S2) foram submetidas à extração de DNA e RNA. Para a análise de NGS, DNA e RNA (cDNA) de 5 amostras S1 foram sequenciados usando MiSeq (Illumina, San Deigo, CA) e as diferenças analisadas pelo teste de Mann Whitney (P <0,05). A atividade metabólica de Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 e Selenomonas spp. foi determinada pela razão rRNA/DNA baseada nos enasios de qPCR de 20 amostras pareadas S1-S2. Para a revisão sistemática, foram incluídos estudos moleculares que identificaram espécies bacterianas antes e após o PQC. A meta-análise foi realizada com o RStudio. Resultados: Os dados de NGS revelaram que Bacteroidales [G-2] bacterium HMT 274, Porphyromonas endodontalis, Tannerella forsythia, Alloprevotella tannerae, Prevotella intermedia, Pseudoramibacter alactolyticus, Olsenella sp. HMT 809 e Olsenella sp. HMT 939 foram membros ativos (rRNA/DNA 1) nas infecções primárias. Os ensaios de qPCR revelaram que a concentração de cópias de rRNA de Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 nas amostras S2 foi maior do que os níveis correspondentes de DNA (P < 0,05). Por outro lado, houve uma redução da atividade de Selenomonas spp. após o PQC. Os resultados da revisão sistemática e meta-análise mostraram que a prevalência de espécies de difícil cultivo nas amostras pós-preparo foi baixa (<17%), sendo representadas principalmente por Firmicutes e Bacteroidetes. Conclusão: (1) a estratégia integrada de NGS baseada em DNA e rRNA foi particularmente importante para revelar a atividade de bactérias ainda não cultivadas; (2) Bacteroidaceae [G-1] bacterium HMT 272 permaneceu metabolicamente ativo após o PQC; (3) bactérias de difícel cultivo são encontradas em baixa prevalência em amostras pós-instrumentação.