Estudo da fosforilação da Cwc24 como fator de splicing em Saccharomyces cerevisiae - Girotto, Thierry Pueblo Freitas (2019)
Splicing é o nome dado à reação de remoção de íntrons em pré-RNAs e ligação de éxons para formar mRNAs maduros. É catalisado pelo spliceossomo, um complexo altamente dinâmico formado por snRNPs, associações entre snRNAs e proteínas, facilitando o processo de excisão das sequências não codificadoras por meio de duas reações de transesterificação. O spliceossomo é montado de novo em cada pré-RNA que será processado. Para isso, a montagem é sequencial e coordenada em grande parte pelas interações proteicas, as quais são cuidadosamente reguladas, muitas vezes por modificações pós-traducionais, como fosforilação, ubiquitinação, sumoilação, entre outras, que podem influenciar as funções das proteínas, e consequentemente, etapas durante o splicing. Uma proteína essencial em Saccharomyces cerevisiae que possui um papel fundamental no splicing é Cwc24, responsável por proteger o 5´SS (splice site) de um ataque nucleofílico prematuro durante a primeira reação de transesterificação, e que auxilia na estabilização da ligação do complexo U2 snRNP ao pré-RNA. Cwc24 interage com diversas proteínas da maquinaria de splicing. Através de ensaios de high throughput de proteômica, foram identificados sítios de fosforilação em Cwc24. Partindo desta informação, o objetivo deste trabalho foi o de caracterizar o papel da fosforilação de Cwc24 no controle de sua função durante o splicing em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos confirmaram que Cwc24 é fosforilada nos seus dois resíduos de serinas identificados por análise proteômica. Entretanto, mutações nesses dois resíduos de serina não afetaram a viabilidade celular em condições normais e em condições de estresse de crescimento. Testes de estabilidade proteica mostraram que as substituições dos aminoácidos também não possuíam um efeito na estabilidade desta proteína. As mutações também não alteraram o processamento de pré-RNA. A fosforilação de Cwc24 está presente no contexto da interação com outros fatores de splicing, porém não é crucial para a interação, uma vez que o mutante fosfodeficiente é capaz de interagir com as mesmas proteínas da mesma forma que a proteína selvagem. Assim, os resultados obtidos nos permitiram concluir que a fosforilação da Cwc24 pode estar envolvida em algum outro processo celular que possa estar interligado ao splicing de pré-RNA, ou que seu efeito na função de Cwc24 seja muito sutil para ser percebido através da metodologia utilizada.