Validação de genes diferencialmente expressos identificados em células MCF-7 com diferenças de expressão de PAR-4 (Prostate Apoptosis Response-4) antes e após a exposição de docetaxel - Melo, Natália Cruz e (2016)
O PAWR (Prostate apoptosis response- 4) também conhecido como PAR-4 é um gene pró-apoptótico identificado em células de câncer de próstata quando expostas a estímulos apoptóticos. A expressão de PAR-4 pode aumentar a sensibilidade da célula a apoptose, incluindo células de câncer de mama. Ensaios de expressão gênica por transcriptoma foram realizados em nosso laboratório (dados ainda não publicados), com o objetivo de analisar genes diferencialmente expressos associados à quimiossensibilidade ao docetaxel em células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão para PAR-4 (MCF7pcPAR4) e o com vetor vazio (MCF7pcNEO) antes e após o tratamento com docetaxel. Para avaliar a interação entre os genes diferencialmente expressos foram geradas redes gênicas funcionais utilizando o programa IPA- Ingenuity®. Dentre as diversas redes gênicas geradas destacaram-se as que continham genes relacionados direta ou indiretamente com a via de sinalização WNT (Wingless-Type MMTV Integration 1). O presente estudo visa validar genes diferencialmente expressos identificados em células MCF-7 com diferenças de expressão de PAR-4 antes e após a exposição de docetaxel. Através da anotação manual dos genes mais diferencialmente expressos, foram selecionados os genes EGR1, XAF1, TARP e WNT5A para validação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). A plataforma Human WNT Signaling Pathway RT2 Profiler(TM) PCR Array (PCR Array) foi utilizada para avaliar o efeito da overexpressão de PAR-4 e do tratamento de docetaxel na expressão de genes das vias canônica e não canônica do WNT. A expressão positiva do gene WNT5A nas células MCF7pcPAR4 em relação a MCF7pcNEO foi confirmada por qRT-PCR na ausença e presença do tratamento com docetaxel. O gene EGR1 apresentou regulação positiva significativa na técnica de qRT-PCR na ausência de tratamento, porém não apresenta o mesmo perfil de expressão observado no ensaio de transcriptoma. O gene XAF1 apresentou regulação negativa nas células MCF7pcPAR4 quando comparadas com as células MCF7pcNEO na ausência e presença de docetaxel, com tendência a validação na ausência de tratamento e de não validação na presença de docetaxel. Foi observado o aumento significativo da expressão de TARP nas células MCF7pcPAR4 por qRT-PCR na ausência e presença de docetaxel, porém esses achados não confirmam os resultados obtidos no transcriptoma. Em nossos dados de PCR Array na comparação MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO antes do tratamento, encontramos diferença de expressão significativa (p < 0,005) em 9 genes. Sendo que, os genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 e TWIST apresentaram expressão positiva e os genes NTRK2, SOX2, SOX9 e WISP1 tiveram expressão negativa. Na comparação na presença de docetaxel observamos que os genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 e TWIST apresentaram regulação positiva e FST apresentou regulação negativa com significância estatística (p < 0,005). Dos 84 genes da plataforma PCR array foram observados 21 e 14 genes comuns entre ambas às técnicas na ausência e presença de docetaxel, respectivamente. Na ausência de docetaxel 16 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão, dentre estes a regulação positiva de GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 e TWIST, associadas á regulação negativa de CDH1, JAG1, NTRK2 sugerem ativação da via WNT/?-catenina. Enquanto, a expressão de DAB2, WNT5A, FZD7 e RUNX2 indica inativação dessa via. Na presença do tratamento 6 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão. Dentre estes, a regulação positiva de CTGF, DAB2 e EGR1 sugerem inativação da via WNT/beta-catenina. Por outro lado, a expressão positiva de FGF20, LEF1 e PDGFRA sugerem que via WNT/beta-catenina estaria ativa. Neste estudo, podemos mostrar que PAR-4 modula genes da via de sinalização WNT. Porém, mais experimentos serão necessários para verificar quais mecanismos estão envolvidos e de que forma isso reflete na quimiossensibilidade a drogas