Efeito da interação entre hexâmeros de septinas e a região BD3 da proteína reguladora Borg3 no processo de formação de filamentos de septinas - Castro, Danielle Karoline Silva do Vale (2022)
A família das septinas se caracteriza por ligar nucleotídeos de guanina e formar heterocomplexos que podem se associar formando filamentos que, por sua vez, podem formar estruturas de ordem superior tais como feixes e anéis. Essas estruturas são consideradas a forma biologicamente ativa das septinas, uma vez que a forma monomérica destas proteínas não possui função conhecida. Famílias reguladoras de septinas tem ganhado cada vez mais espaço na literatura e, dentre elas, a família de proteínas chamada BORG tem sido descrita como possível reguladora da formação de filamentos de septinas e de sua arquitetura. Neste trabalho, nós estudamos a influência da região BD3 da proteína Borg3 no processo de polimerização dos hexâmeros de septinas formado pelas proteínas SEPT2, SEPT6 e SEPT7 além de construções faltando combinação dos domínios C-terminais, buscando delimitar a região de interação. Os ensaios de polimerização foram realizados in vitro em tampões de alta e baixa força iônica e, em seguida, a amostra foi adsorvida em grades de cobre cobertas por um filme ultrafino de carbono descarregadas negativamente. As imagens foram obtidas por microscopia eletrônica de transmissão por contrastação negativa. Em seguida, utilizamos as técnicas biofísicas de pull-down, desnaturação térmica monitorada por dicroísmo circular e SEC-MALS para caracterizar a região de interação em solução e, a partir destes dados, modelos tridimensionais foram gerados utilizando-se o programa de inteligência artificial AlphaFold2_advanced do DeepMind. Os experimentos de polimerização demonstraram que a região BD3 da proteína Borg3 é capaz de induzir a polimerização, em ambas as condições de força iônica, apenas para o complexo hexamérico selvagem. A região de interação foi determinada pelos ensaios de pull-down utilizando as diferentes construções das proteínas e, concluiu-se que a interação é estabelecida pelos domínios C-terminais do heterodímero SEPT6-SEPT7 e a região BD3, formando uma espécie final significativamente mais estável termicamente. Estruturas tridimensionais mostraram que a região BD3 se encaixa em um cavidade central do coiled-coil heterodimérico SEPT6C-SEPT7C. A validação do modelo utilizando-se os mutantes SEPT6E354L e SEPT7K368R permitiu demonstrar que a interação é específica e ocorre em apenas um dos lados da superfície do coiled-coil.