Investigação dos fenótipos e efeitos da expressão da proteína VAPB humana em Saccharomyces cerevisiae como modelo para Esclerose Lateral Amiotrófica - Palma, Flávio Romero (2016)
A Esclerose Lateral Amiotrófica é uma doença neurodegenerativa que afeta seletivamente neurônios motores. A maior parte dos casos de ELA (90%) é esporádica. Para os casos familiais, mais de vinte genes já foram associados. Diversos mecanismos estão envolvidos na patogênese, entre eles o estresse oxidativo, proteostase e agregação, excitoxicidade, tráfego intracelular, entre outros. A mutação P56S na proteína VAPB está associada à ELA8. A VAPB é uma proteína de membrana do retículo endoplasmático e está possivelmente envolvida em diversas funções celulares, dentre elas tráfego intracelular, interação retículo endoplasmático-aparelho de Golgi e UPR. Sabendo que mutações no gene que codifica VAPB resultam em ELA e que indivíduos com a mesma mutação neste gene podem apresentar quadros clínicos bastante diferentes, propõe-se estudar a suscetibilidade ao estresse oxidativo e ao estresse do retículo endoplasmático e as possíveis vias de degradação das proteínas mutantes como fatores subjacentes a essa heterogeneidade clínica. Desta forma, objetivou-se realizar uma análise integrada de ELA8, buscando compreender os mecanismos moleculares envolvidos na doença, utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo para estudo. Foram obtidas diferentes linhagens BY4741 de S. cerevisiae, expressando os genes de VAPBWT e VAPBP56S ou o plasmídeo vazio (que foi utilizado como controle em todos os experimentos) sob controle do promotor GAL1. Foram avaliadas as viabilidades das células expressando as proteínas humanas, a sua localização celular e possível formação de agregados. Os resultados mostram que a expressão da proteína VAPBP56S é tóxica e leva à formação de agregados dispersos nas células, enquanto a expressão da proteína selvagem se concentra no retículo endoplasmático e não altera significativamente a viabilidade das células. Scs2 é a proteína de levedura homóloga a VAPB, e a deleção do gene correspondente gera linhagens auxotróficas para inositol. VAPBWT e VAPBP56S foram expressas em linhagem nocaute para o gene Scs2, a fim de analisar se os homólogos humanos complementam a auxotrofia a inositol. Observou-se que a linhagem expressando a proteína selvagem é capaz de restaurar o fenótipo selvagem e a linhagem expressando a proteína mutante não. Para avaliar os efeitos de estresse oxidativo nas linhagens BY4741, foram determinados: a viabilidade e sensibilidade das linhagens sob condições de estresse induzido por H2O2, a razão GSH/GSSG e a produção de H2O2 por mitocôndrias, além da viabilidade após tratamento com o antioxidante N-acetil-L-cisteína. De modo geral foi verificado que a linhagem expressando a proteína mutante é discretamente mais sensível ao tratamento com H2O2, possui menor razão GSH/GSSG, e produz mais H2O2 em mitocôndrias isoladas. Em conjunto, estes dados sugerem alteração no metabolismo redox a partir da expressão de VAPBP56S. Os efeitos da inibição do proteassomo (ΔPdr5 + MG132) e da autofagia (ΔAtg8) foram avaliados em ensaios de viabilidade e degradação proteica. Verificou-se que a inibição do proteassomo tem maior efeito sobre a viabilidade das linhagens expressando VAPBWT e diminui a degradação desta proteína. A inibição da autofagia, ao contrário, afeta mais a linhagem expressando VAPBP56S. A atividade do proteassomo, a ubiquitinação de proteínas e os níveis de autofagia também foram avaliados, sendo verificado que há maior expressão de subunidades do proteassomo nas linhagens expressando ambas as proteínas. Na linhagem expressando VAPBWT, observou-se maior atividade do proteassomo e uma diminuição no pool de proteínas ubiquitinadas, de acordo com a maior expressão de subunidades do proteassomo. Na linhagem expressando VAPBP56S, ao contrário, há diminuição da atividade do proteassomo e acúmulo de proteínas ubiquitinadas, sugerindo uma inibição do proteassomo. Por meio do monitoramento da fusão GFP-Atg8 foi verificada a maior formação de autofagossomos nas linhagens expressando VAPBP56S, o que sugere maiores níveis de autofagia. Foi avaliada a viabilidade das células sob o efeito do aumento da expressão de Tsa1, uma peroxirredoxina com capacidade de recrutar chaperonas para agregados de forma redox dependente. Observou-se que esta proteína é capaz de atenuar a toxicidade de VAPBP56S, especialmente no ensaio de diluição seriada. Por fim foram verificados os níveis de marcadores de estresse do retículo endoplasmático, Pdi1, Ero1, Lhs1 e Kar2, e de UPR, SHac1, e foi visto que a expressão da proteína mutante alterou todos estes indicadores. Os dados em conjunto sugerem alterações no metabolismo redox e na proteostase resultantes da expressão de VAPBP56S