Estudo das relações funcionais entre proteínas O-gluconaciladas e a sinalização do receptor de angiotensina II do tipo 1 - Silva Neto, Julio Alves da (2023)
Os receptores de sete domínios de membrana (GPCR) são proteínas que, ao serem ativadas por hormônios, neurotransmissores ou fármacos, disparam vias de sinalização intracelular pela ativação de proteínas G, de quinases e da beta-arrestina. O receptor de angiotensina II do tipo I (AT1R) é um GPCR que representa importante alvo terapêutico para o controle da hipertensão arterial e outras condições de risco cardiovascular. Quando ativado pela angiotensina II (Ang II), produz aumento no tônus arterial, liberação de neurotransmissores e reabsorção renal de sódio para a regulação do meio interno. A O-gluconacilação (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional que ocorre em proteínas intracelulares, e que está aumentada em distúrbios metabólicos como o diabetes e a hipertensão. Esta modificação ocorre pela anexação enzimática de uma molécula de N-acetil glucosamina endógena a proteínas intracelulares, gerando mudanças na funcionalidade de proteínas responsáveis por regular a fisiologia de vasos sanguíneos e outros órgãos. Considerando estes dois problemas fisiológicos, o objetivo deste trabalho foi investigar, a partir do perfil de sinalização do AT1R em sistemas biológicos com aumento global de proteínas O-gluconaciladas, a hipótese que o aumento de O-GlcNAc altera a sinalização do AT1R, reduzindo o recrutamento de beta-arrestina, e sustentando por mais tempo os efeitos pró-contráteis e deletérios da Ang II. A hipótese foi avaliada por duas frentes de investigação: inicialmente foram cultivadas células HEK293T expressando estavelmente o AT1R humano. As células foram submetidas a aumento global de proteínas O-gluconaciladas usando o inibidor enzimático thiamet G (TMG 1 µM por 16 horas). Em seguida, o AT1R foi ativado por Ang II, agonista endógeno, ou pelo TRV027, agonista tendencioso para a via da beta-arrestina. Foram quantificadas a potência (pEC50) e a eficácia (Rmax) destes agonistas para a fosforilação de quinases, mobilização de cálcio, recrutamento de beta-arrestina e internalização do receptor. Também foi aferida a densidade de AT1R na membrana. Posteriormente foram feitos experimentos usando artérias mesentéricas isoladas de camundongos espontaneamente diabéticos [C57BLKS/6JLepR-/-(+)]; um modelo nativo de expressão de AT1R e de aumento de proteínas O-gluconaciladas, para se relacionar os achados em células com a disfunção vascular associada ao diabetes. Nestas artérias, o AT1R também foi ativado por Ang II e TRV027 e se mediu, além da pEC50 e Rmax de contração, a taxa de taquifilaxia, o recrutamento de beta-arrestina e o tempo de dessensibilização. Nestas artérias isoladas, foram empregados inibidores das quinases PKC (proteína quinase C, RO 31-8220, 1 µM) e MEK [que induz fosforilação e ativação de ERK 1/2 (quinase regulada por sinal extracelular), PD98059, 10 µM], e o quelante de cálcio citoplasmático BAPTA-AM (10 µM). Nas células HEK293T tratadas com TMG houve aumento persistente de proteínas modificadas por O-GlcNAc e, ao se ativar o AT1R, houve aumento na fosforilação de ERK1/2 e dos transientes de cálcio pelo aumento de O-Gluconacilação. Não houve diferença na densidade ou na taxa de internalização do AT1R, nem no recrutamento de beta-arrestina ou ativação de PKC por ação do TMG. Nos experimentos funcionais em artérias isoladas, a resposta contrátil para Ang II foi maior nos animais db/db, comparando-se às artérias dos camundongos heterozigotos db/+. O estímulo para recrutar beta-arrestina (TRV027) reduziu de maneira igual a eficácia da Ang II em artérias dos dois fenótipos de camundongos. A perda de resposta por taquifilaxia foi igual para artérias dos dois animais. A taxa de dessensibilização do AT1R foi maior nas artérias de db/db se comparadas àquela em artérias de db/+. Um outro conjunto de experimentos usando inibidores de quinases foi conduzido para se aferir a participação da ERK 1/2 e da PKC no aumento de contratilidade. Por último, se investigou a contribuição do cálcio intracelular no aumento de eficácia da Ang II nas artérias mesentéricas usando BAPTA. A contratilidade vascular em animais db/db desta vez foi menor que nas preparações não tratadas. Tendo em mãos estes dados, conclui-se que o aumento da eficácia da Ang II diante de elevado conteúdo de O-GlcNAc intracelular ocorre em razão de uma maior biodisponibilidade de íons cálcio como mensageiro secundário e não por uma atuação reduzida da beta-arrestina sobre o receptor.