Produção, extração e purificação integrada de proteases com atividade fibrinolítica produzida por fungos do gênero Rhizopus e sua caracterização bioquímica - SANTOS, Steliane Lima (2022)
Enzimas com atividade fibrinolítica são obtidas de diferentes fontes e possuem a capacidade de degradar a fibrina, o principal componente proteico dos coágulos sanguíneos. O acúmulo de fibrina nos vasos pode gerar trombose, uma doença que ocorre quando há formação de coágulos sem haver sangramento. Nesse sentido, o objetivo desta tese foi selecionar fungos filamentosos do gênero Rhizopus, produzir e extrair proteases fibrinolíticas por fermentação submersa, fermentação extrativa e sistema de duas fases aquosas (PEG/Citrato), além de caracterizar bioquimicamente a enzima. Para a seleção do microorganismo foi realizada uma fermentação submersa com fungos do gênero Rhizophus, utilizando um planejamento fatorial 2³ completo para determinar as melhores condições de produção. A influência das variáveis tipo de substrato (TS), concentração do substrato (CS) e concentração de glicose (CG) foram avaliadas sobre a produção da protease fibrinolítica. A enzima produzida foi extraída por sistema de duas fases aquosas (SDFA) constituído de polietilenoglicol (PEG) e citrato de sódio, sendo realizado de acordo com um planejamento fatorial 24, para avaliar a influência das variáveis: massa molar de PEG (MPEG), concentração de PEG (CPEG), concentração de citrato de sódio (Ccit) e pH, sobre o coeficiente de partição (K), recuperação(Y%) e fator de purificação (FP). Em seguida a enzima foi caracterizada em parâmetros bioquímicos e cinéticos. Um planejamento fatorial 24 também foi realizado para avaliar a influência de MPEG, CPEG, Ccit e pH sobre o K e Y na fermentação extrativa. A protease fibrinolítica de Rhizopus arrhizus UCP 1605 foi produzida nas condições de 3% de soja, e 0,5% de glicose, sob agitação de 120 rpm, a 30ºC por 96 horas de fermentação submersa, apresentando uma atividade proteásica de 10,37 U/mL e uma atividade fibrinolítica com um halo de 31 mm, correspondendo a uma atividade de 850,60 U/mL. Quanto à extração em SDFA, os melhores resultados foram obtidos no ensaio formado por 24,0 % (m/m) de PEG 8000, 15 % (m/m) de citrato de sódio e pH 8. Nesta condição a enzima particionou preferencialmente para fase rica em PEG, com um K de 1,58, FP 4,07, Y de 97,0% e uma atividade fibrinolítica com um halo de 16 mm, correspondendo a uma atividade de 44,39 U/mL. No processo de fermentação extrativa a enzima particionou para ambas as fases, tendo a melhor condição no ensaio composto por PEG 8000 g/mol, na concentração de 20%, 15% de citrato e pH 8,0, apresentando um K de 2,4 e recuperação de atividade (Y) 71,5% e 3,83 U/mL de atividade proteásica. A enzima presente no tanto no extrato enzimático, quanto no SDFA apresentaram temperatura ótima de 50ºC e pH ótimo 8. Quanto aos parâmetros cinéticos o extrato enzimático apresentou constante de Michaelis Menten (Km) de 4,06 mg/mL com velocidade máxima de 45,05 U/mL. A enzima obtida por fermentação extrativa não foi caracterizada bioquimicamente. Esses resultados demonstram o potencial da produção de Rhizopus arrhizus UCP 1605 em fermentação submersa e dos processos de extração da protease fibrinolítica e sua possibilidade para ser explorado em aplicações industriais como candidatos a agentes trombolíticos.